Avaliação do papel da via FAK/SRC na proliferação e apoptose em linhagem celular JAK2V617F positiva

dc.contributorRibeiro, Raquel Tognon
dc.contributorhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/busca.do?metodo=apresentar
dc.contributorAntunes, Michelle Bueno de Moura Pereira
dc.contributorhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/busca.do?metodo=apresentar
dc.contributorPinto, Mariana Tomazini
dc.contributorhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/busca.do?metodo=apresentar
dc.contributorCastro, Sandra Bertelli Ribeiro de
dc.contributorhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/busca.do?metodo=apresentar
dc.creatorValente, Ana Carolina Menezes Mendonça
dc.date2022-11-23T11:44:39Z
dc.date2022-11-22
dc.date2022-11-23T11:44:39Z
dc.date2022-10-23
dc.date.accessioned2023-09-29T15:12:04Z
dc.date.available2023-09-29T15:12:04Z
dc.identifierhttps://doi.org/10.34019/ufjf/di/2022/00242
dc.identifierhttps://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/14657
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/9126431
dc.descriptionChronic Myeloproliferative Neoplasms (NMPC), which includes Polycythemia vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are clonal disorders characterized by excess of proliferation and apoptosis resistance, leading to accumulation of myeloid cells. The identification of the acquired JAK2V617F mutation in patients with PV, ET and PMF allowed a better understanding about this disease pathogenesis, as the constitutive activation of JAK2 tyrosine kinase plays an important role in increasing cell proliferation and resistance to apoptosis. However, there is still no pharmacological treatment that leads all patients to molecular remission, justifying the study of new molecular targets. In turn, the Focal Adhesion Kinase (FAK) protein has an important influence on the processes of proliferation, migration and cell survival and, as it is overexpressed in several neoplasms, it becomes a promising target in the development of drugs cancer. The present study proposes to evaluate the role of FAK in the proliferation and apoptosis of SET-2 cells, a JAK2V617F positive cell line. With this purpose, the following were analyzed: (1) interaction between FAK and SRC by immunoprecipitation; (2) the effect of the FAK inhibitor (PF 562,271) on the viability and cell proliferation by MTT; (3) the effect of the FAK inhibitor on apoptosis induction by evaluating the expression of cleaved PARP and cleaved Caspase 3 by Western Blotting, (4) the effect of JAK inhibitor (ruxolitinib) on the expression of p-SRC and SRC. In addition, a RNAseq dataset from SET-2 cells treated with INC424 (ruxolitinib) for 4h and 48h (GSE 69827), available in "Gene Expression Omnibus" was analyzed. The differential gene expression and correlation of PTK2 gene and other 65 genes related to proliferation, survival, apoptosis and adhesion were performed using the software R studio. The results indicate that the inhibitor of FAK PF 562,271 significantly reduced in 71.5%, 85.5%, 83.7% and 86.3% the cell viability at 5uM, 10uM, 25uM and 50uM, respectively. The inhibitor also induced apoptosis, since there was an increase in the expression of cleaved PARP and cleaved Caspase 3 after treatment with the inhibitor. The analysis of the RNAseq database showed that the JAK inhibitor modulated the expression of PTK2 gene and other genes involved in proliferation, apoptosis and cell adhesion processes. Regarding the genes related to cell adhesion, the genes PTK2, SRC, PXN, TLN1, DCC, ITPKC and FLNA showed increased expression and CRK, PTRH2, VCL, CASS4, ACTB, ZYX, VASP, CTNNB1 and BCAR1 showed decreased expression. In conclusion, the results indicate that FAK inhibition sensibilizes SET-2 to apoptosis, reducing cell viability and JAK inhibition with INC424 seems to have influence in PTK2 gene expression and other genes related to focal adhesion pathway.
dc.descriptionAs Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas (NMPC) configuram-se como um grupo de doenças clonais da célula-tronco hematopoética que resultam em acúmulo das células mieloide. Dentre elas incluem-se a Policitemia vera (PV), a Trombocitemia essencial (TE) e a Mielofibrose Primária (MF). A identificação da mutação adquirida JAK2V617F em pacientes com PV, TE e MF permitiu o melhor entendimento da patogênese dessas doenças, visto que a ativação constitutiva da tirosina quinase JAK2 tem papel importante no aumento da proliferação celular e resistência à apoptose. No entanto, ainda não existe um tratamento farmacológico que leve todos os pacientes à remissão molecular, justificando o estudo de novos alvos moleculares. Por sua vez, a proteína Quinase de Adesão Focal (FAK), possui importante influência nos processos de proliferação, migração, sobrevivência celular e apoptose e, por estar superexpressa em diversas neoplasias, configura-se um alvo promissor no desenvolvimento de fármacos contra o câncer. O presente estudo propõe avaliar o papel da proteína FAK na proliferação e apoptose da linhagem celular SET-2, positiva para a mutação JAK2V617F. Assim, foram analisados: (1) interação entre FAK e SRC por imunoprecipitação; (2) o efeito do inibidor da FAK (PF 562,271) na viabilidade e proliferação celular por MTT; (3) efeito do inibidor da FAK na indução da apoptose avaliando-se a expressão de PARP clivado e Caspase 3 Clivada por Western Blotting; (4) efeito do inibidor da JAK (ruxolitinibe) na expressão de p-SRC e SRC. Além disso, um banco de dados de RNAseq da linhagem SET-2 tratada com INC424 (ruxolitinibe) por 4h e 48h (GSE 69827), disponível no banco de dados público "Gene Expression Omnibus" foi analisado. A expressão gênica diferencial e a correlação entre a expressão do gene PTK2 e outros 65 genes envolvidos em proliferação, sobrevivência, apoptose e adesão foi feita utilizando-se o software R studio. Os resultados indicam que o inibidor da FAK PF 562,271 reduziu significativamente a viabilidade celular e a proliferação das células SET-2 a partir da concentração de 5 µM, sendo 71,5%, 85,5%, 83,7% e 86,3% a redução da viabilidade para os tratamentos com 5 µM,10µM, 25 µM e 50 µM, respectivamente. O inibidor também induziu apoptose, pois houve aumento na expressão de PARP clivada e Caspase 3 clivada após tratamento. As análises do banco de dados de RNAseq demonstraram que o inibidor da JAK modulou a expressão do gene PTK2 e de outros genes envolvidos nos processos de proliferação, apoptose e adesão celular. Com relação aos genes relacionados com adesão celular, os genes PTK2, SRC, PXN, TLN1, DCC, ITPKC e FLNA apresentaram aumento da expressão e CRK, PTRH2, VCL, CASS4, ACTB, ZYX, VASP, CTNNB1 e BCAR1 apresentaram expressão diminuída. Com isso, os resultados do presente trabalho apontam que a inibição da FAK sensibiliza a linhagem celular SET-2 a sofrer apoptose, reduzindo assim a viabilidade e o tratamento com o inibidor da JAK INC424 influencia na expressão do gene PTK2 e de outros genes relacionados com a via de adesão focal.
dc.descriptionFAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
dc.publisherBrasil
dc.publisherICV - Instituto de Ciências da Vida
dc.publisherPrograma de Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular
dc.publisherUFJF
dc.rightsAcesso Embargado
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
dc.rightshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
dc.subjectFAK
dc.subjectNeoplasias mieloproliferativas crônicas
dc.subjectJanus quinase 2
dc.subjectApoptose
dc.subjectChronic myeloproliferative neoplasms
dc.subjectJanus kinase 2
dc.subjectApoptosis
dc.subjectCNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
dc.titleAvaliação do papel da via FAK/SRC na proliferação e apoptose em linhagem celular JAK2V617F positiva
dc.typeDissertação


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