Dissertação de mestrado
Cultura de linhagem miogênica l6 como modelo experimental para análise da ação de fármacos na proteólise muscular esqueléticaEfeito do amp cíclico extracelular
Fecha
2016-10-31Registro en:
ELOI, Fernanda Rodrigues. Cultura de linhagem miogênica l6 como modelo experimental para análise da ação de fármacos na proteólise muscular esqueléticaEfeito do amp cíclico extracelular. 2016. Dissertação (Mestrado) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
2016-0383.pdf
Autor
Eloi, Fernanda Rodrigues [UNIFESP]
Institución
Resumen
Introdução: A quantificação do aminoácido tirosina para avaliação da proteólise muscular pode ser realizada por dois métodos experimentais: dosagem fluorimétrica, realizada em músculo esquelético de roedores e dosagem radiométrica, realizada em cultura de células. Já foi descrito que a ativação da cascata de sinalização mediada por GsPCR/ AC/ AMPc é capaz de atenuar a proteólise muscular. Contudo, o uso crônico de agonistas de adrenoceptores ?2 está associado a efeitos colaterais nos músculos cardíaco e esquelético devido à não seletividade. A ativação do GsPCR promove o aumento da concentração do AMPc intracelular. O término de ação do AMPc é mediado pela sua degradação por PDE intracelulares e/ ou pelo seu efluxo para o meio extracelular. Uma vez presente no espaço intersticial, o AMPc sofre ação de ecto-enzimas responsáveis pela sua metabolização em adenosina, que ativa receptores de adenosina, permanecendo desconhecido os efeitos do AMPc extracelular na proteólise muscular. Objetivos: Estabelecer a cultura de fibras musculares de linhagem L6 como modelo para quantificação da tirosina por método fluorimétrico, para avaliar a possível ação moduladora do AMPc extracelular e o efeito de fármacos na proteólise de fibras musculares. Métodos: Foram utilizadas culturas de fibras musculares de linhagem L6 para análise da proteólise basal e induzida pelo jejum. Para isso, as culturas foram tratadas com clembuterol, isoproterenol, AMPc, adenosina, DMPX e CGS 15943, por 1 a 5 h. A proteólise foi determinada pelo método fluorimétrico e os resultados foram apresentados como nmol de tirosina/placa ou em porcentagem de tirosina liberada. Este trabalho possui aprovação do comitê de ética em pesquisa UNIFESP 5523140415. Resultados: É possível quantificar a tirosina com amostras de volume ? 60 ?L. A ciclohexamida (0,5 mM) aumentou em 55% a liberação de tirosina no meio de incubação, sendo a liberação tempo-dependente, não havendo interferência da ciclohexamida (0,01-1000 ?M) na viabilidade celular. A inibição dos sistemas proteolíticos das calpaínas dependente de Ca2+ e do sistema ubiquitina-proteassoma dependente de ATP promoveu a redução de 14 e 38%, respectivamente, na liberação de tirosina. A incubação das culturas com isoproterenol (10-1000 nM) e clenbuterol (10-100 nM) por 2 h reduziu a proteólise em até 20%, sendo este efeito foi mantido por até 4 h. O tratamento das culturas com AMPc (10?1000 ?M) por 2 a 4 h reduziu a proteólise em até 24%, sendo este efeito mantido por até 5 h. O mesmo foi observado para a incubação das culturas com adenosina (0,01 ? 10 ?M) por 4 h, reduzindo a proteólise em até 28%. A incubação das culturas com AMPc na presença de CGS 15943 e DMPX aboliu o efeito anti-proteolítico do AMPc anteriormente observado. Além disso, o tratamento das culturas com AMPc (1 mM) por 2 h reduziu em até 11% o catabolismo exacerbado induzido pelo jejum. Conclusões: Em conjunto, nossos dados mostraram que: a) é possível quantificar a tirosina liberada de cultura de células pelo método fluorimétrico em volumes ? 60 ?L; b) cultura de fibras musculares de linhagem L6 pode ser utilizada como modelo experimental para a triagem de fármacos com ação anti-proteolítica; c) a via do AMPc extracelular está relacionada tanto com a regulação da proteólise basal quanto da proteólise induzida pelo jejum de fibras musculares em cultura; possivelmente através da adenosina e ativação de receptores A2, d) A via extracelular AMPc-adenosina pode atuar como um modulador na manutenção da massa muscular, apresentando um efeito secundário na controle da proteólise muscular.