Las infecciones nosocomiales (IN) constituyen un problema médico, social y económico, representando una de las principales causas de morbimortalidad en el paciente, siendo las áreas de atención a pacientes en estado crítico y recién nacidos las más afectadas por dichas infecciones. El presente estudio se realizó con el objetivo de determinar la frecuencia de bacilos Gram negativos (posibles agentes etiológicos de IN) en muestras ambientales procedentes de la Unidad de Neonatología de diferentes centros hospitalarios de la ciudad de Cumaná, estado Sucre. Se tomaron muestras ambientales de la Unidad de Neonatología del Servicio Autónomo del Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” (Centro I) y de tres Centros hospitalarios privados (Centro II, III, IV), según el método de análisis por sedimentación en placas. Se aislaron 53 cepas de ambiente, las cuales se identificaron mediante métodos bioquímicos convencionales, encontrándose una mayor proporción de bacilos Gram negativos (52,83%), en relación a los Gram positivos (47,17%); la mayoría de estos, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, destacándose la Escherichia coli con una frecuencia de aislamiento del 35,70%, seguida de Citrobacter sp. (28,57%); Klebsiella pneumoniae (21,43%) y Pseudomonas aeruginosa (14,29%). El Centro I presentó el mayor porcentaje de bacilos Gram negativos, probablemente debido a que representa un centro hospitalario público, donde normalmente existe poco control de los sistemas de vigilancia epidemiológica. En cuanto a los patrones de susceptibilidad expresados por las especies aisladas en los Centros hospitalarios escogidos para el presente estudio, éstas mostraron altos porcentajes de resistencia a la mayoría de los antimicrobianos probados. Todas las especies bacterianas aisladas en el Centro I expresaron fenotipo de BLEE (β-lactamasas de espectro extendido), siendo Escherichia coli y Citrobacter sp. las más frecuentes (100%), seguida de Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa (50%). En vista de los resultados obtenidos, se sugiere tomar medidas que disminuyan, en cada servicio médico, la frecuencia tanto de bacterias circulantes como de IN. Esto, mediante la adopción de programas de vigilancia y control de las mismas.