Tese de doutorado
HIV cell tropism: from diagnosis to viral evolution
Fecha
2016-02-05Registro en:
ARIF, Muhammad Shoaib. HIV cell tropism: from diagnosis to viral evolution. 2016. 189 f. Tese (Doutorado em Infectologia) - Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2016.
2016-0475.pdf
Autor
Arif, Muhammad Shoaib [UNIFESP]
Institución
Resumen
HIV-1 tropism to co-receptors CCR5 or CXCR4 relates to disease progression and cytopathic effects of the virus. Furthermore, antagonists to co-receptors have become valuable addition to the arsenal of antiretroviral drugs. Assessing co-receptor tropism is mandatory for the prescription of these drugs. Phenotypic assays are usually recommended over genotypic assays to infer co-receptor tropism. The prediction on maintaining or switching HIV-1 co-receptor usage over time is still uncertain. Here in this thesis we have presented a new phenotypic tropism assay and evaluated evolution of co-receptor tropism in two different cohorts of individuals infected with HIV-1. First, we have successfully developed a new phenotypic assay based on 450 bp C2V3 region of HIV-1 envelope. Initially, this phenotypic assay is developed with reference HIV-1 strains with known tropism and validated with the TRT phenotypic assay that uses a slightly bigger fragment (~750 bp) compared to our assay. One of the major advantages of the tropism assay developed herein is the small fragment size and the possibility of adaption to use with proviral DNA and could be used to infer tropism for individuals with plasma viral load <1,000 copies/ml. Secondly, genotypic co-relates of tropism were evaluated in a cohort of HIV-1 infected individuals after recent infection. Tropism was assessed with the Geno2pheno web portal that offers different false positive rate (FPR) cutoffs with the probability to classify an R5 tropic virus falsely as CXCR4 using virus. Geno2pheno generate results graded as FPR and can be adapted according to patient´s needs. No significant association was observed between CXCR4 using strains and viral load, CD4 counts, timing for treatment, GBV-C co-infection and HLA or clade profile. However, we were able to identify 9 individuals with a co-receptor switch to use CXCR4. 6 of these individuals remained treatment naïve during the study period. Strains with intermediate FPR were identified during evolution towards CXCR4 usage and a consistent trend of decreasing FPR over time was observed with a mean evolution time of 27.29 (range: 8.90-64.62) months. Majority of R5 viruses were observed with a baseline FPR>50% and remained R5 during the study period whereas individuals showing viruses with a co-receptor switch to CXCR4 use had baseline FPR<50%. Logistic regression analysis was performed to determine the potential of FPR to predict co-receptor switching over time. We determined that viruses with an FPR of 40.6% presented a stable FPR over time, whereas lower FPRs tend to progressively decay leading to emergence of CXCR4 using strains. The area under the ROC curve for the predicted cutoff level was 98%. Last, we have studied the impact of thalidomide use on HIV co-receptor tropism in an open label, randomized, controlled, pilot proof of concept clinical trial carried out in 30 HIV infected ART naïve male individuals. Thalidomide use resulted in a decline of CD4/CD8 ratio (p=0.08) and CD4+ T cell counts (p=0.04) in the treatment group compared to control group, however, these changes were observed to be independent of the viral type/subtype and co-receptor tropism profiles. O tropismo do HIV-1 aos correceptores CCR5 e CXCR4 relaciona-se a progressão da doença e citopatogenicidade. Alem disso, medicamentos antagonistas de CCR5 tornaram-se medicamentos úteis no arsenal de terapêutico dos anti-retrovirais. Portanto, a determinação do tropismo do HIV é obrigatória para a prescrição desses medicamentos. Ensaios fenotípicos são o padrão ouro para determinação do tropismo do HIV-1. Previsão sobre a manutenção ou mudança do tropismo do HIV pelos co-receptores CCR5 ou CXCR4 ao longo do tempo ainda é incerta. Aqui nesta tese nós apresentamos um novo ensaio de tropismo fenotípico e avaliado a evolução do tropismo do HIV ao longo do tempo em duas coortes diferentes de indíviduos infectados pelo HIV-1. Primeiro, foi desenvolvido com sucesso um novo ensaio fenotípico baseado em fragmento de 450 pb da região C2V3 da gp120 do envelope do HIV-1. Inicialmente, este ensaio foi desenvolvido com cepas referência do HIV-1 com tropismo conhecido e validado com o ensaio fenotípico TRT que utiliza um fragmento pouco maior (~750 pb) em comparação com o nosso ensaio. Uma das principais vantagens do ensaio desenvolvido aqui é o pequeno tamanho do fragmento e a possibilidade de adaptação para usar com DNA proviral podendo determinar o tropismo do HIV-1 entre indivíduos com carga viral plasmática <1.000 cópias/mL. Segundo, evolução do tropismo pelos co-receptores foi avaliado em uma coorte de indivíduos recém-infectados. Tropismo foi avaliada com o portal Geno2pheno que oferece diferentes pontos de cutoff de taxa de falsos positivos (FPR) com a probabilidade falsamente classificar um variante R5 como o virus usando CXCR4. Geno2pheno gerar resultados classificados como FPR e pode ser adaptado de acordo com as necessidades do paciente. Não houve associação significativa entre variantes que utilizam o CXCR4 e cargas virais para o RNA do HIV, níveis de células T CD4+, tempo para o tratamento, co-infecção pelo GBV-C, perfil do HLA ou subtipo do HIV. No entanto, fomos capazes de identificar os 9 indivíduos com um mudança de torpismo para CXCR4. Seis destes indivíduos permaneceram virgens do tratamento durante o período do estudo. Variantes com FPR intermediário foram identificados durante evolução para CXCR4 e uma tendência consistente de diminuir FPR ao longo do tempo foi observada com um tempo de evolução médio de 27,29 (intervalo: 8.90-64.62) meses. Maioria dos indivíduos com variantes R5 apresentavam HIV-1 com FPR basal >50%, mantendo-se portadores de variantes R5 durante o período de estudo enquanto que os indivíduos que mostram virus com mudanca de tropismo para CXCR4 apresentavam FPR basal <50%. A análise de regressão logística foi realizada para determinar o potencial de FPR em prever a mudança de tropismo ao longo do tempo. Determinou-se que os pacientes com vírus com FPR superior a 40,6% apresentaram virus com FPR estável ao longo do tempo, ao passo que FPRs mais baixas tendem a queda progressiva destes valores progressivamente levando a aparecimento de cepas trópicas pelo CXCR4. A área sob a curva ROC para o nível de corte previsto era de 98%. Por último, temos estudado o impacto do uso da talidomida sobre tropismo do HIV em um ensaio clínico piloto aberto, randomizado, prova de conceito realizado em trinta indivíduos masculinos adultos virgens de tratamento antirretroviral infectadas pelo HIV. Embora o uso de talidomida resultasse em uma diminuição da relação CD4/CD8 (p=0,08) e contagens de células T CD4 (p=0,04) no grupo de tratamento comparado ao grupo controle, no entanto, estas alterações observadas foram independentes do subtipo do HIV-1 e tropismo do virus, sendo que não houve influência do uso de talidomida no tropismo do HIV-1 ao longo do tempo em comparação ao grupo controle.