Libro
Disminución del impacto ambiental en el control del parásito Haemonchus contortus en ovinos
Disminución del impacto ambiental en el control del parásito Haemonchus contortus en ovinos
Autor
Masaquiza Moposita, Diego Armando; Escuela Superior Politécnica de Chimborazo - Sede Orellana. Facultad de Ciencias Pecuarias. Carrera de Zootecnia. Francisco de Orellana – Ecuador
Díaz Hernandez, Arnielis; Universidad de Camagüey “Ignacio Agramonte Loynaz”, Centro de Biología Molecular, Camagüey 74650, Camagüey, Cuba
Cabezas Andrade, Leonardo Daniel; Escuela Superior Politécnica de Chimborazo - Sede Orellana. Facultad de Ciencias. Carrera Ambiental. Francisco de Orellana - Ecuador
Herrera Morales, Greys Carolina; Escuela Superior Politécnica de Chimborazo - Sede Orellana. Facultad de Ciencias. Carrera Ambiental. Francisco de Orellana - Ecuador
Vaca Cárdenas, Maritza Lucia; Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Facultad de Ciencias Pecuarias. Carrera de Zootecnia. Riobamba – Ecuador
Arenal Cruz, Amilcar; Universidad de Camagüey “Ignacio Agramonte Loynaz”, Centro de Biología Molecular, Camagüey 74650, Camagüey, Cuba
Institución
Resumen
Las parasitosis por nematodos gastrointestinales (NGI) constituyen el problema más generalizado y desafiante para la industria de los pequeños rumiantes en todo el mundo (Torres-Acosta, Molento, & De Gives, 2012). De los NGI que parasitan a los ovinos y caprinos y que posee una distribución mundial, es sin dudas H. contortus el más importante. Los animales infectados padecen anemia, edema, diarrea, debilidad, emaciación e incluso la muerte, especialmente cuando se trata de animales jóvenes (Taylor, Coop, & Wall, 2007b).
En Cuba H. contortus constituye el parásito de mayor prevalencia e incidencia, que limita seriamente el desarrollo de la ganadería ovina (Arece & López, 2013). Estudios en el país muestran un 73,8 % de prevalencia en la provincia Las Tunas (Medina, 2019).
contortus tiene un ciclo de vida directo, sin ningún hospedero intermediario. Los huevos morulados son ovopositados por las hembras del parásito para luego ser expelidos al medio ambiente a través de las heces. Cada hembra del nematodo puede llegar a expulsar más de 5000 huevos por día, lo que hace que aumente vertiginosamente la cantidad de larvas en el medio y se conviertan en una seria amenaza para la salud de los animales.
De la eclosión de los huevos resulta el primer estadio larval (L1) con mudas sucesivas hasta llegar a la fase infectante (L3) en un periodo de siete días bajo condiciones favorables. Las L3 son extremadamente resistentes a los ambientes hostiles ya que poseen una cubierta protectora. Los animales se infectan a través del alimento o el agua contaminada con las L3 (Lee, 2002).
Dos de las características que distinguen al H. contortus son su alta prevalencia en la mayoría de las regiones del mundo y su elevada capacidad para desarrollar resistencia a múltiples medicamentos usados en su tratamiento. Es por ello que un diagnóstico certero tiene importantes implicaciones para el estudio de su biología, epidemiología, estrategias de control y resistencia a los medicamentos (Yang et al., 2017).
El fenómeno de resistencia a múltiples drogas químicas por parte de H. contortus requiere del desarrollo de estrategias de lucha, encaminadas a descubrir nuevos medicamentos antihelmínticos y candidatos vacunales capaces de proteger a los animales contra la infestación del nematodo, basados en estudios que identifiquen moléculas claves para sus procesos de desarrollo y reproducción.
Para C Britton, Roberts, and Marks (2016) es imprescindible el conocimiento profundo de los procesos biológicos a nivel molecular del H. contortus, que permitan llegar a identificar algunas de estas moléculas claves como nuevos objetivos farmacológicos. Es por ello que se necesita con urgencia estudios inmunológicos contra las infecciones por nematodos del ganado. Después de la vacunación con extractos de proteínas nativas se logra una protección significativa contra H. contortus, lo que demuestra que la búsqueda de vacunas es factible (Mohandas et al., 2016).
Aparejado al problema de resistencia a las drogas químicas, existe una tendencia hacia la disminución de los residuos de fármacos en los alimentos destinados al hombre y en el medio ambiente, lo cual supone que las estrategias de control antiparasitarias no dependan exclusivamente de los productos químicos. Entre las estrategias propuestas se encuentran el desarrollo de vacunas específicas contra los nematodos gastrointestinales y el empleo de animales genotípicamente resistentes a las infecciones parasitarias (Alba-Hurtado & Muñoz-Guzmán, 2012).
Hasta la fecha, se emplean varios antígenos nativos y recombinantes en ensayos de inmunización contra H. contortus, con una protección variable en la mayoría de los casos (Meier, Torgerson, & Hertzberg, 2016). De igual manera, también se prueban diferentes estrategias de vacunación, que incluyen el empleo de vacunas de ADN (Han, Xu, Yan, Song, & Li, 2012) y de variados adyuvantes (Piedrafita et al., 2013).
Si se tiene en cuenta las funciones esenciales que poseen algunas proteasas en la nutrición y la supervivencia de los helmintos en el huésped, estas se consideran candidatas para el desarrollo de vacunas contra este grupo de parásitos. Las cisteína-proteasas, que se describen en la mayoría de los helmintos parásitos, se proponen como una fuente alternativa de antígenos (Toet, Piedrafita, & Spithill, 2014).
En el caso particular de H. contortus, las cisteína-proteasas también se usan como inmunógenos contra el nematodo en diferentes ensayos de vacunación con el uso de formas nativas o recombinantes en cabras y ovejas (Muleke et al., 2007). Tal es así que la inmunización con fracciones enriquecidas con tiol proteinasa obtenidas del H. contortus adulto o sus productos de excreción-secreción (E/S) inducen una importante protección contra el parásito. Sin embargo, los mecanismos inmunológicos subyacentes a la protección son poco conocidos (J. M. Molina et al., 2018).
La identificación de epítopos es esencial para el diagnóstico, la inmunoterapia, el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de vacunas para el tratamiento de enfermedades (Pande, Szewczyk, & Grover, 2010). Las bibliotecas de presentación de fagos constituyen un método rápido y de bajo costo para mapear epítopos de un antígeno que esté involucrado en una interacción de proteína específica con el anticuerpo y son consideradas una herramienta potente que permite la selección de mimotopos de péptidos que imitan epítopos naturales de un patógeno, incluso sin conocimiento previo del área del ligando natural (Ellis, Newlands, Nisbet, & Matthews, 2012).
El ARN de interferencia (ARNi) es una herramienta genética atractiva que permite la validación de objetivos farmacológicos y la identificación de genes diana en parásitos de interés veterinario. Los problemas con su sensibilidad variable a los enfoques estándar de ARNi reducen el desarrollo de plataformas de silenciamiento de genes (Maule et al., 2011).
El silenciamiento de genes puede desencadenarse mediante la introducción del ARN de doble cadena (ARNdc) en un organismo.
El procesamiento posterior de la doble cadena y la incorporación dentro del complejo de silenciamiento conduce a la división del ARN mensajero específico del gen (ARNm) que comparte la secuencia homóloga con el ARNdc (Filipowicz, 2005). El fenotipo resultante de los niveles de transcripción reducidos después de la introducción del ARNi puede sugerir o indicar la(s) función(es) del gen específico y su importancia para el organismo huésped y, además, puede informar sobre su potencial como un nuevo objetivo de intervención (Marr, Sargison, Nisbet, & Burgess, 2014).
En el silenciamiento de genes en H. contortus se emplean genes vitales del parásito, entre ellas, H11 (Samarasinghe, Knox, & Britton, 2011) responsable en la absorción de nutrientes, sec-23 (Geldhof, Murray, et al., 2006) con función en el transporte de vesículas y β-tubulina (A. C. Kotze & Bagnall, 2006) que forma los microtúbulos que con los microfilamentos de actina constituyen el citoesqueleto y es responsable del movimiento de los músculos (Cooper, 2000). Sin embargo, son pocos los estudios con éxito de silenciamiento de genes en H. contortus (Zawadzki, Presidente, Meeusen, & De Veer, 2006).
Con este antecedente se plantea el siguiente problema científico: ¿Puede reducirse la infestación de H. contortus en ovinos a través de la inmunización con epítopos de proteínas vitales provenientes de una biblioteca de fagos presentadora de péptidos?
En base a esto se busca demostrar la disminución de H. contortus en ovinos inmunizados con péptidos mimotopos de proteínas vitales del nematodo que participan en la respuesta inmune natural contra el parásito. En este sentido se proyectan diferentes experimentos como: identificar epítopos de proteínas de H. contortus involucradas en la respuesta inmune a través de una biblioteca de fagos presentadora de péptidos; optimizar el silenciamiento de genes en H. contortus con el empleo del gen de la β-tubulina, evaluar el efecto sobre la motilidad y el desarrollo larval del silenciamiento en H. contortus de los genes de β-tubulina y DIM 1; y determinar la reducción de la carga de H. contortus en ovinos con el empleo de un péptido que mimifique epítopos del parásito.
De la misma manera, este pesquisaje en la biblioteca de fagos constituye:
El primer informe de empleo de esta herramienta en la identificación de proteínas involucradas en la respuesta inmune contra Haemonchus en ovinos.
La optimización del silenciamiento de genes en Haemonchus representa el primer estudio de esta naturaleza.
Es el primer informe de selección y silenciamiento de un gen novel (DIM 1) que sea vital para Haemonchus
La compilación de este libro se divide en 4 capítulos, 2 de los cuales son introductorios, el tercero da a conocer sobre la obtención de las muestras y procesamiento, además de una identificación de mimotopos en una Biblioteca de fagos. El cuarto capítulo, indica en forma detallada los estudios de caso:
El CAPÍTULO 1, menciona aspectos de H. contortus, ciclo biológico, prevalencia, diagnóstico, control, afectaciones y pérdidas económicas e impacto ambiental de los desparasitantes.
En el CAPÍTULO 2, se trata sobre la resistencia parasitaria, desarrollo de vacunas, respuesta inmunológica del hospedero, bibliotecas de fago para el control de parásitos, silenciamiento de genes en parásitos.
El CAPÍTULO 3, explica el ensayo inmunoenzimático (elisa), obtención de huevos de H. contortus, conteo de huevos por gramo de heces – técnica de mcmaster, coprocultivos estériles, selección y preparación de un animal donante de huevos, obtención de las l1 para el experimento de inmunoneutralización, obtención de las L3 para los experimentos de silenciamiento, así mismo se presenta la identificación de mimotopos similares a H. contortus a través de una biblioteca de fagos.
Los estudios de caso se abordan en el CAPÍTULO 4: donde se realiza la optimización de transferencia de genes en h. contortus para el silenciamiento de genes vitales y la evaluación de un péptido con epítopos de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gapdh) y de desorganización muscular (dim 1) en la protección de ovinos contra H. contortus. Las parasitosis por nematodos gastrointestinales (NGI) constituyen el problema más generalizado y desafiante para la industria de los pequeños rumiantes en todo el mundo (Torres-Acosta, Molento, & De Gives, 2012). De los NGI que parasitan a los ovinos y caprinos y que posee una distribución mundial, es sin dudas H. contortus el más importante. Los animales infectados padecen anemia, edema, diarrea, debilidad, emaciación e incluso la muerte, especialmente cuando se trata de animales jóvenes (Taylor, Coop, & Wall, 2007b).
En Cuba H. contortus constituye el parásito de mayor prevalencia e incidencia, que limita seriamente el desarrollo de la ganadería ovina (Arece & López, 2013). Estudios en el país muestran un 73,8 % de prevalencia en la provincia Las Tunas (Medina, 2019).
contortus tiene un ciclo de vida directo, sin ningún hospedero intermediario. Los huevos morulados son ovopositados por las hembras del parásito para luego ser expelidos al medio ambiente a través de las heces. Cada hembra del nematodo puede llegar a expulsar más de 5000 huevos por día, lo que hace que aumente vertiginosamente la cantidad de larvas en el medio y se conviertan en una seria amenaza para la salud de los animales.
De la eclosión de los huevos resulta el primer estadio larval (L1) con mudas sucesivas hasta llegar a la fase infectante (L3) en un periodo de siete días bajo condiciones favorables. Las L3 son extremadamente resistentes a los ambientes hostiles ya que poseen una cubierta protectora. Los animales se infectan a través del alimento o el agua contaminada con las L3 (Lee, 2002).
Dos de las características que distinguen al H. contortus son su alta prevalencia en la mayoría de las regiones del mundo y su elevada capacidad para desarrollar resistencia a múltiples medicamentos usados en su tratamiento. Es por ello que un diagnóstico certero tiene importantes implicaciones para el estudio de su biología, epidemiología, estrategias de control y resistencia a los medicamentos (Yang et al., 2017).
El fenómeno de resistencia a múltiples drogas químicas por parte de H. contortus requiere del desarrollo de estrategias de lucha, encaminadas a descubrir nuevos medicamentos antihelmínticos y candidatos vacunales capaces de proteger a los animales contra la infestación del nematodo, basados en estudios que identifiquen moléculas claves para sus procesos de desarrollo y reproducción.
Para C Britton, Roberts, and Marks (2016) es imprescindible el conocimiento profundo de los procesos biológicos a nivel molecular del H. contortus, que permitan llegar a identificar algunas de estas moléculas claves como nuevos objetivos farmacológicos. Es por ello que se necesita con urgencia estudios inmunológicos contra las infecciones por nematodos del ganado. Después de la vacunación con extractos de proteínas nativas se logra una protección significativa contra H. contortus, lo que demuestra que la búsqueda de vacunas es factible (Mohandas et al., 2016).
Aparejado al problema de resistencia a las drogas químicas, existe una tendencia hacia la disminución de los residuos de fármacos en los alimentos destinados al hombre y en el medio ambiente, lo cual supone que las estrategias de control antiparasitarias no dependan exclusivamente de los productos químicos. Entre las estrategias propuestas se encuentran el desarrollo de vacunas específicas contra los nematodos gastrointestinales y el empleo de animales genotípicamente resistentes a las infecciones parasitarias (Alba-Hurtado & Muñoz-Guzmán, 2012).
Hasta la fecha, se emplean varios antígenos nativos y recombinantes en ensayos de inmunización contra H. contortus, con una protección variable en la mayoría de los casos (Meier, Torgerson, & Hertzberg, 2016). De igual manera, también se prueban diferentes estrategias de vacunación, que incluyen el empleo de vacunas de ADN (Han, Xu, Yan, Song, & Li, 2012) y de variados adyuvantes (Piedrafita et al., 2013).
Si se tiene en cuenta las funciones esenciales que poseen algunas proteasas en la nutrición y la supervivencia de los helmintos en el huésped, estas se consideran candidatas para el desarrollo de vacunas contra este grupo de parásitos. Las cisteína-proteasas, que se describen en la mayoría de los helmintos parásitos, se proponen como una fuente alternativa de antígenos (Toet, Piedrafita, & Spithill, 2014).
En el caso particular de H. contortus, las cisteína-proteasas también se usan como inmunógenos contra el nematodo en diferentes ensayos de vacunación con el uso de formas nativas o recombinantes en cabras y ovejas (Muleke et al., 2007). Tal es así que la inmunización con fracciones enriquecidas con tiol proteinasa obtenidas del H. contortus adulto o sus productos de excreción-secreción (E/S) inducen una importante protección contra el parásito. Sin embargo, los mecanismos inmunológicos subyacentes a la protección son poco conocidos (J. M. Molina et al., 2018).
La identificación de epítopos es esencial para el diagnóstico, la inmunoterapia, el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de vacunas para el tratamiento de enfermedades (Pande, Szewczyk, & Grover, 2010). Las bibliotecas de presentación de fagos constituyen un método rápido y de bajo costo para mapear epítopos de un antígeno que esté involucrado en una interacción de proteína específica con el anticuerpo y son consideradas una herramienta potente que permite la selección de mimotopos de péptidos que imitan epítopos naturales de un patógeno, incluso sin conocimiento previo del área del ligando natural (Ellis, Newlands, Nisbet, & Matthews, 2012).
El ARN de interferencia (ARNi) es una herramienta genética atractiva que permite la validación de objetivos farmacológicos y la identificación de genes diana en parásitos de interés veterinario. Los problemas con su sensibilidad variable a los enfoques estándar de ARNi reducen el desarrollo de plataformas de silenciamiento de genes (Maule et al., 2011).
El silenciamiento de genes puede desencadenarse mediante la introducción del ARN de doble cadena (ARNdc) en un organismo.
El procesamiento posterior de la doble cadena y la incorporación dentro del complejo de silenciamiento conduce a la división del ARN mensajero específico del gen (ARNm) que comparte la secuencia homóloga con el ARNdc (Filipowicz, 2005). El fenotipo resultante de los niveles de transcripción reducidos después de la introducción del ARNi puede sugerir o indicar la(s) función(es) del gen específico y su importancia para el organismo huésped y, además, puede informar sobre su potencial como un nuevo objetivo de intervención (Marr, Sargison, Nisbet, & Burgess, 2014).
En el silenciamiento de genes en H. contortus se emplean genes vitales del parásito, entre ellas, H11 (Samarasinghe, Knox, & Britton, 2011) responsable en la absorción de nutrientes, sec-23 (Geldhof, Murray, et al., 2006) con función en el transporte de vesículas y β-tubulina (A. C. Kotze & Bagnall, 2006) que forma los microtúbulos que con los microfilamentos de actina constituyen el citoesqueleto y es responsable del movimiento de los músculos (Cooper, 2000). Sin embargo, son pocos los estudios con éxito de silenciamiento de genes en H. contortus (Zawadzki, Presidente, Meeusen, & De Veer, 2006).
Con este antecedente se plantea el siguiente problema científico: ¿Puede reducirse la infestación de H. contortus en ovinos a través de la inmunización con epítopos de proteínas vitales provenientes de una biblioteca de fagos presentadora de péptidos?
En base a esto se busca demostrar la disminución de H. contortus en ovinos inmunizados con péptidos mimotopos de proteínas vitales del nematodo que participan en la respuesta inmune natural contra el parásito. En este sentido se proyectan diferentes experimentos como: identificar epítopos de proteínas de H. contortus involucradas en la respuesta inmune a través de una biblioteca de fagos presentadora de péptidos; optimizar el silenciamiento de genes en H. contortus con el empleo del gen de la β-tubulina, evaluar el efecto sobre la motilidad y el desarrollo larval del silenciamiento en H. contortus de los genes de β-tubulina y DIM 1; y determinar la reducción de la carga de H. contortus en ovinos con el empleo de un péptido que mimifique epítopos del parásito.
De la misma manera, este pesquisaje en la biblioteca de fagos constituye:
El primer informe de empleo de esta herramienta en la identificación de proteínas involucradas en la respuesta inmune contra Haemonchus en ovinos.
La optimización del silenciamiento de genes en Haemonchus representa el primer estudio de esta naturaleza.
Es el primer informe de selección y silenciamiento de un gen novel (DIM 1) que sea vital para Haemonchus
La compilación de este libro se divide en 4 capítulos, 2 de los cuales son introductorios, el tercero da a conocer sobre la obtención de las muestras y procesamiento, además de una identificación de mimotopos en una Biblioteca de fagos. El cuarto capítulo, indica en forma detallada los estudios de caso:
El CAPÍTULO 1, menciona aspectos de H. contortus, ciclo biológico, prevalencia, diagnóstico, control, afectaciones y pérdidas económicas e impacto ambiental de los desparasitantes.
En el CAPÍTULO 2, se trata sobre la resistencia parasitaria, desarrollo de vacunas, respuesta inmunológica del hospedero, bibliotecas de fago para el control de parásitos, silenciamiento de genes en parásitos.
El CAPÍTULO 3, explica el ensayo inmunoenzimático (elisa), obtención de huevos de H. contortus, conteo de huevos por gramo de heces – técnica de mcmaster, coprocultivos estériles, selección y preparación de un animal donante de huevos, obtención de las l1 para el experimento de inmunoneutralización, obtención de las L3 para los experimentos de silenciamiento, así mismo se presenta la identificación de mimotopos similares a H. contortus a través de una biblioteca de fagos.
Los estudios de caso se abordan en el CAPÍTULO 4: donde se realiza la optimización de transferencia de genes en h. contortus para el silenciamiento de genes vitales y la evaluación de un péptido con epítopos de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gapdh) y de desorganización muscular (dim 1) en la protección de ovinos contra H. contortus.
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