Tesis Doctorado
Influencia de las o-glicosilaciónes sobre la velocidad de hidratación y estructura de mucinas respiratorias
Autor
Espinosa-de la Fuente, Marisol
Institución
Resumen
El moco es un gel polimérico e hidrofílico que cubre diversas superficies epiteliales y es parte del mecanismo de defensa innato presente en el tracto respiratorio humano.Las diversas partículas inhaladas y agentes patógenos que quedan atrapados enéste, son eliminados a través. del transporte mucociliar ("clearence" mucociliar). El moco, está formado por una matriz polimérica (1%), agua (95%) y también iones y otras proteínas (2%). La matriz polimérica está formada principalmente por mucinas que pertenecen a una familia de glicoproteínas polianiónicas de alto peso molecular(2-30 MDa), que se caracterizan por tener un alto contenido de azúcares O-ligados al eje de proteína. Dos tipos principales de mucinas secretadas han sido descritas en el moco respiratorio humano; MUCSAC y MUC5B. Las mucinas son liberadas al medioextracelular mediante exocitosis y forman un hidrogel (mucus gel) sólo después desu hidratación. Las características fisicoquímicas de las mucinas, como también la forma en que se interconectan unas con otras en solución, son factoresdeterminantes de la viscosidad del moco. Sin embargo, escasos son los estudios querelacionan el contenido de 0-oligosacáridos de las mucinas, tanto con la velocidad de hidratación de ellas, como con el contenido de estructura secundaria de la matriz polimérica de mucinas. Estudios realizados en moco respiratorio proveniente de pacientes con patologías respiratorias hipersecretorias (fibrosis quística, asma bronquial y bronquitis obstructiva), han mostrado que la estructura glicosilada de las mucinas presenta mayor grado de sulfatación, fucosilación y sialilación con respectoa personas sanas. Estos cambios moleculares contribuyen al aumento en laadhesión de bacterias al moco y al aumento de la viscosidad del moco, con unconcomitante deterioro en la eficiencia del clearence mucociliar. Estos antecedentespermitieron proponer que "Las 0-glicosilaciones determinan la estructura secundaria de las mucinas y afecta la velocidad de hidratación de la matriz granular durante la exocitosis". Se desarrolló un protocolo de cultivo celular, que permitió obtener célulasdel epitelio respiratorio, particularmente del tipo mucosecretor. A partir de este modelo biológico, se determinó el efecto de la inhibición de la 0-glicosilación (con Benzii-GaiNAc 0,2 y 2 mM, por 24 h), sobre la síntesis y liberación de mucinas. Se realizó la purificación de MUC5AC, a través de sedimentación al equilibrio ysedimentación por velocidad en medios condicionados controles y post tratamiento con Benzii-GaiNAc. Además, se comparó la velocidad de hidratación de la matriz de gránulos secretorios en presencia y ausencia de 0-oligosacáridos. Finalmente, se determinó el contenido de estructura secundaria de la mucina MUC5AC 0-glicosilada y desglicosilada. La técnica de cultivo utilizada permitió obtener células que expresaron y secretaron principalmente la mucina MUC5AC en dos formas, glicosilada y desglicosilada. La inhibición de la 0-glicosilación, redujo dramáticamente la secreción de MUC5AC glicosilada y también aumentó el coeficiente de difusión de los gránulos secretados post tratamiento con Benzil-GaiNAc 2mM. Estos antecedentes demuestran que la O-glicosilación determina el estado oligomérico de la mucina MUC5AC, aumenta el coeficiente de difusión de la matriz granular de gránulos exocitados en cultivo y probablemente modifica la estructura secundaria de las mucinas secretadas. Todos estos antecedentes sugieren que el contenido de carbohidratos O-ligados a las mucinas, podrían determinar los cambios en las propiedades visco-elásticas del mucus respiratorio, através de su participación en la determinación del estado oligomérico de las mucinas secretadas. Los resultados apoyan la importancia de los carbohidratos O-ligados a la configuración de la matriz del moco y contribuyen a explicar las alteracionespatológicas del moco en cuadros respiratorios hipersecretorios. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Biomédicas 161p. PFCHA-Becas TERMINADA