Tesis Doctorado
Inhibición de la expresión del gen de la deshidrogenasa aldehídica: evaluación del sistema de rna de interferencia
Autor
Cortínez-Flores, Gabriel
Institución
Resumen
El alcoholismo es una enfermedad multifactorial que genera una serie de trastornos
personales, sociales y de salud pública. Según estimaciones del Ministerio de Salud de
Chile el abuso en el consumo de alcohol y el alcoholismo causa pérdidas al país por
US$3.000 millones anuales.
Luego de la oxidación hepática del etanol, el acetaldehído generado es metabolizado a
acetato por la deshidrogenasa aldehídica 2 (ALDH2*1). En la población Asiática existen
individuos que poseen una variante de la ALDH2 con baja actividad (ALDH2*2) los que
experimentan un marcado aumento del acetaldehído sanguíneo después de una
ingesta alcohólica. Este incremento del acetaldehído causa diversos efectos tales
como el enrojecimiento facial, palpitaciones, hipotensión, cefaleas y náuseas (conocido
como "fenotipo asiático") los que producen un rechazo al consumo del alcohol. Los
heterocigotos (ALDH2*11ALDH2*2) beben moderadamente, mientras que los
homocigotos (ALDH2*2IALDH2*2) son abstemios.
El tratamiento farmacológico del alcoholismo se basa en el uso de diversos
medicamentos como la naltrexona y el acamprosato que actúan en el sistema nervioso
central bloqueando los receptores de endorfinas y NMDA, inhibiendo la sensación de
placer asociada al alcohol o disminuyendo los síntomas de la abstinencia alcohólica.
Otro fármaco utilizado es el disulfiram, un modificador químico de grupos sulfhidrilos,
que inhibe la ALDH2 produciendo un aumento en el nivel de acetaldehído cuando el
paciente bebe alcohol, emulando el fenotipo asiático. Estos fármacos requieren
administración diaria lo que a causa de la baja adhesión a los tratamientos
farmacológicos, reduce su eficacia terapéutica. Un nuevo fármaco de efecto prolongado, que emule el fenotipo asiático sin los efectos secundarios del disulfiram,
sería de gran ayuda en el campo del alcoholismo.
En esta tesis se evaluó la utilidad de dos algoritmos para diseñar racionalmente
siRNAs eficientes que disminuyan la actividad de la ALDH2, mediante la degradación
selectiva de su mensajero. El objetivo final fue generar un siRNA como herramienta
genética en el campo del alcoholismo o como posible fármaco para su tratamiento.
Se diseñaron y estudiaron tres RNAs interferentes dirigidos a distintos sitios del RNA
mensajero de la ALDH2 de rata. Dos de ellos disminuyen en 60-70% la actividad de la
ALDH2 en células humanas HEK-293 que expresan el gen de la enzima de rata.
Empleando la secuencia del RNA interferente más prometedor (siRNA2) se diseñaron
y probaron tres genes que, estando bajo el control del promotor del RNA U6 humano,
dan origen a horquillas de RNA (shRNA a, b y c) precursoras del siRNA2. El shRNAc,
codificado en un plásmido, disminuyó en 50% la actividad de la ALDH2 en células
HEK-293. La reducción de actividad concuerda con el 60% de disminución de su
mensajero. Esta disminución es específica, puesto que el mensajero de la -actina y el
de IFITM-1 se mantuvieron constantes. La transducción de células de hepatoma de
rata H4-11-E-C3 con un vector adenoviral de fa generación que codifica la misma
horquilla (AdV-shRNAc) disminuyó en 10-15% la actividad de la ALDH2 endógena. La
pérdida de eficiencia probablemente se debe a la inhibición de exportina 5 y Dicer, por
acción del RNA VAl codificado en los adenovirus.
Finalmente, los algoritmos permitieron diseñar siRNAs que reducen la actividad de la
ALDH2 por sobre el 50%. La transfección de células humanas (HEK-293) con dos de
los tres siRNAs sintetizados químicamente o con un plásmido que codifica un shRNA, redujeron sig n ifi cativa mente la actividad de la ALDH2 en células humanas,
estableciendo que la interferencia por RNA es una estrategia de silenciamiento génico
de utilidad para disminuir la actividad de la ALDH2. PFCHA-Becas Doctor en Bioquímica 121 p. PFCHA-Becas TERMINADA