Tesis Doctorado
Análisis molecular y funciónal de genes involucrados en la síntesis y acumulación de flavonoides durante el desarrollo de frutos en vitis vinifera l. Cv. Carménère
Autor
Pérez-Díaz, José Ricardo
Institución
Resumen
En V. vinifera, antocianinas y proantocianidinas (PAs, taninos condensados) son
los principales flavonoides presentes en los frutos, los cuales son asociados a
propiedades organolépticas en vinos tintos tales como color y astringencia. Su síntesis y
acumulación está restringida principalmente a la piel y semilla de las bayas desde donde
son extraídos durante el proceso de vinificación. A la fecha han sido caracterizados
muchos de los genes estructurales de la síntesis de antocianinas y PAs en vid (ej.
VvDFR, VvLDOX, VvANR, VvLAR). Por su parte, algunos factores de trascripción
MYB-R2R3 han sido relacionados con la regulación del metabolismo de los
flavonoides, la mayoría actuando como inductores de la expresión de genes
estructurales. Sin embargo, algunos miembros de esta familia regulan negativamente la
síntesis de flavonoides en otras plantas. Durante el desarrollo de esta tesis se aisló y
caracterizó parcialmente al gen VvMYB4-like, el cual codifica un putativo represor
transcripcional en vid. La proteína de este gen mostró una localización nuclear y el
análisis de expresión de VvMYB4-like en vid indicó que sus transcritos son mayormente
acumulados en pieles de frutos en pre envero, además de hojas. Su sobre-expresión en
plantas de tabaco produjo una drástica reducción de la pigmentación de los pétalos de
sus flores en comparación a las plantas silvestres. El análisis de los posibles genes
regulados por VvMYB4-like mostró una fuerte represión de dos de los genes claves de
la síntesis de antocianinas/flavonoides en tabaco, DFR y ANS/LDOX. Estos resultados
sugieren, que VvMYB4-like se encontraría regulando la síntesis de flavonoides en vid
mediante la represión de genes claves para su biosíntesis.
Una vez que los flavonoides son sintetizados en el citoplasma, estos son
transportados principalmente a la vacuola para su almacenamiento. En la planta modelo
Arabidopsis thaliana, tres tipos de proteínas transportadoras han sido implicadas en este
proceso, una glutation S-transferasas (GST) codificada por TT19, una proteína tipo
MATE codificada por TT12, y una bomba de protones (H+
-ATPasa) codificada por
AHA10.
En esta tesis se identificaron y analizaron genes de vid homólogos a los
transportadores de flavonoides anteriormente mencionados. Genes que codifican para
tres proteínas GST descritas en frutos, fueron evaluados transcripcionalmente durante el
desarrollo de frutos en el cv Carménère. VvGST1 se expresó en piel y semilla pero su inducción fue mucho mayor en este último órgano, en tanto que VvGST3 fue expresado
casi exclusivamente en semillas, indicando que ambos genes pudiesen cumplir una
importante función en dicho órgano. El gen VvGST4, el cual previamente mostró
participar en el transporte se antocianinas, presentó un perfil de expresión que se
correlacionó con la acumulación de estos pigmentos en pieles. Sin embargo, su
capacidad para complementar el fenotipo del mutante tt19-1 de Arabidopsis fue
evaluada, observándose que es capaz de restaurar la acumulación de antocianinas en
tejido vegetativo de esta planta modelo pero aparentemente no el transporte de PAs en
sus semillas. Dos genes de vid, denominados VvAHA10.1 y VvAHA10.2 y homólogos a
AHA10 de Arabidopsis y PH5 de petunia relacionados con el transporte de flavonoides,
fueron analizados transcripcionalmente en tejido reproductivo y de frutos en desarrollo.
VvAHA10.1 fue expresado principalmente en pieles de frutos, mostrando una buena
correlación con la acumulación de flavonoides reportada para frutos en vid, mientras
que los transcritos del gen VvAHA10.2 fueron débilmente detectados en frutos, con una
alta expresión en flores, indicando que ambos genes se encuentran relacionados con
procesos diferentes. En este sentido, la sobre-expresión de VvAHA10.1 en plantas de
tabaco afectó la pigmentación de las flores, observándose un notable incremento en la
coloración de los pétalos respecto a las plantas no transformadas. Este resultado sugiere
la participación de este gen en la acumulación de flavonoides en vid.
Varios estudios han sugerido, que el gradiente de protones generado por bombas
H
+
-ATPasas como la codificada por AtAHA10 en Arabidopsis es esencial para el
transporte de flavonoides mediado por transportadores MATE. En vid, se han
identificado dos transportadores MATE involucrados en el transporte de antocianinas
(AM1 y AM3), sin embargo, a la fecha no se han caracterizado transportadores de PAs.
En esta tesis se analizó la expresión de dos genes denominados VvMATE1 y VvMATE2,
cuyas proteínas presentan alta homología con transportadores de PAs en plantas. El
patrón de expresión espacial y temporal de ambos genes MATE mostró una buena
correlación con el patrón de acumulación de PAs reportado para vid, específicamente de
epicatequina. Las proteínas codificadas por ambos genes mostraron distintas
localizaciones subcelulares en protoplastos de Arabidopsis. VvMATE1:GFP fue
localizada en la membrana vacuolar al igual que otras proteínas MATE transportadoras
de PAs, en cambio VvMATE2:GFP se localizó en el aparato de Golgi. Todos estos
antecedentes permiten sugerir que VvMATE1 y VvMATE1 pudiesen estar actuando
como putativos transportadores de PAs en vid. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Mención Ingeniería Genética Vegetal 124p. PFCHA-Becas TERMINADA