Tesis Doctorado
Estructura y función de aspartato aminotransferasa mitocondrial: efecto de mutagénesis sitió dirigida sobre su estabilidad, plegamiento e importación a la matriz mitocondrial.
Autor
Yañez-Carcamo, Alejandro Javier
Institución
Resumen
La isoenzima mitocondrial aspartato aminotransferasa (mAspAT) es una enzima dimérica
dependiente de piridoxal fosfato. Esta enzima que es sintetizada en el citoplasma se
encuentra codificada en el genoma nuclear en forma de precursor mitocondrial
(pmAspAT). Este precursor, de hígado de rata, contiene una secuencia señal de 29
aminoácidos en la región amino terminal, presecuencia que es esencial para su envio y
transiocación a la matriz mitocondrial. Incubaciones prolongadas del pmAspAT recién
sintetizado en un ambiente citosólico como es el usado de reticulocitos de conejo (RRL),
han mostrado que esta proteína adquiere lentamente en el tiempo la resistencia a la
hidrólisis por tripsina, propiedad característica de la proteína plegada activa. Además, se
observó que al final de esta incubación esta proteína es capaz de unir piridoxal fosfato
(PLP), tiene actividad catalítica y pierde la capacidad de ser importada a la matriz
mitocondrial. Estos resultados sugieren que el proceso que se está observando es el del
plegamiento de pmAspAT recién sintetizado en lisado de reticulocitos. La adición de
cofactor y la concentración del material sintetizado en RRL no afecta la tasa de
plegamiento del precursor. Sin embargo, este proceso resultó ser dependiente de la
temperatura y de ATP. Estos resultados son presentados como un modelo de estudio in
vitro más cercano a las condiciones in vivo del plegamiento de proteínas mitocondriales
oligoméncas en la presencia de componentes citoplasmáticos celulares.
La región amino terminal de rnAspAT contiene dos residuos triptófanos en la posición 5
y 6 que se encuentran altamente conservados. El análisis cristalográfico de mAspAT de
pollo, muestra que estos dos residuos participan en la interacción entre las dos
subunidades de la enzima. Específicamente, estos dos residuos presentes en la región
amino terminal de una subunidad interactuarían con un bolsillo hidrofóbico localizado en
el dominio menor de la subunidad vecina. Para estudiar la importancia de estos residuos en la estabilidad general de la proteína, en el plegamiento y en su función en la
importación a mitocondrias, se preparó por mutagénesis sitio dirigida una serie de
mutantes simples y dobles. Utilizando el ambiente citosólico del usado de reticulocitos
seguimos el plegamiento de estos mutantes. Un grupo de mutantes tipificado por W5V y
W5F/W6F, mostró tener una cinética de plegamiento en usado de reticulocitos similar a
la de la proteína silvestre. Mientras que otro grupo tipificado por el doble mutante
W5A/W6A mostró ser practicamente incapaz de plegarse. Estos resultados sugieren que
la característica hidrofóbica de ambos residuos triptófanos es crítica para el proceso de
plegamiento de la enzima dimérica sintetizada en Usado de reticulocitos. Sin embargo, la
tasa de plegamiento del mutante W5V fue muy similar a la proteína silvestre mientras que
la sustitución del triptófano 6 también por valina disminuyó considerablemente la tasa de
plegamiento de pmAspAT. Resultados similares fueron obtenidos con otros pares de
mutantes. Estos resultados indican que la presencia del residuo triptófano en posición 6
es más crítica en el plegamiento de la enzima que la presencia del triptófano en posición
5. La única sustitución del residuo 6 que no perturbó el plegamiento de la enzima fue el
cambio de triptófano a fenilalanina. Cabe mencionar que el porcentaje de plegamiento de
los mutantes del residuo 5 manteniendo fenilalanina en posición 6 mostró tener una
función directamente lineal con el área de los átomos no polares en la cadena lateral de
los residuos. Estos resultados sugieren el requerimiento de residuos no polares en estas
dos posiciones específicas. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Mención en Biología Molecular y Celular 202p. PFCHA-Becas TERMINADA