| dc.contributor | Romero, Fernando | |
| dc.contributor | Ramirez, Alfredo | |
| dc.contributor | UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA | |
| dc.creator | Hartley, Ricardo | |
| dc.date | 2020-01-03T18:18:19Z | |
| dc.date | 2022-08-23T04:16:05Z | |
| dc.date | 2020-01-03T18:18:19Z | |
| dc.date | 2022-08-23T04:16:05Z | |
| dc.date | 2017 | |
| dc.date.accessioned | 2023-08-21T23:25:53Z | |
| dc.date.available | 2023-08-21T23:25:53Z | |
| dc.identifier | 21120861 | |
| dc.identifier | https://hdl.handle.net/10533/237597 | |
| dc.identifier.uri | https://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8295321 | |
| dc.description | En potros no existe un test que, en forma consistente, pueda predecir la capacidad fértil de su semen. Sin embargo, diversos parámetros han sido usados para evaluar la calidad espermática tanto en muestras frescas, refrigeradas y criopreservadas, vinculándose en menor o mayor medida al potencial fértil de éste. Los parámetros habitualmente evaluados son concentración, motilidad y morfología espermática, pudiendo, en un examen avanzado, considerar la fragmentación de la cromatina nuclear, vitalidad y estabilidad de la membrana plasmática. Sin embargo, aun considerando los parámetros del análisis avanzado, estos no muestran siempre correlación con la fertilidad evaluada en campo.
De ello podemos afirmar que en potros no existe un test que, en forma definitiva, pueda predecir la capacidad fértil del semen. Sin embargo, se consideran como uno de los factores a evaluar en el análisis reproductivo del Potro.
Esta afirmación es corroborada por casos descritos en la literatura donde potros son considerados sub-fértiles o infértiles por la baja o no existencia de preñez post inseminación; sin embargo, la calidad de su semen es óptima y las variables analizadas en el análisis básico y avanzado no pueden predecir éste comportamiento. A su vez, también se ha descartado alteraciones a nivel de la membrana plasmática y la integridad nuclear. Éste es el caso en un grupo de potros, donde los parámetros clásicos no pueden diferenciar entre los animales que exhiben altos o bajos niveles de fertilidad, particularmente post descongelación de su semen, presentando bajos índices de preñez, pudiendo asociarse a baja fecundación o a alteraciones en el desarrollo embrionario.
Entre los parámetros que usualmente no se evalúan se encuentran los asociados al estado de integridad del núcleo espermático. El núcleo del espermatozoide equino, al igual que otros mamíferos, contiene proteínas altamente básicas llamadas protaminas que reemplazan, durante la última etapa de la espermatogénesis, gran parte de las histonas asociadas al DNA nuclear. Las protaminas, al estar cargadas positivamente, exhiben una afinidad mayor por las secuencias de DNA, cargadas negativamente, lo cual permite conformar un núcleo altamente compacto y transcripcionalmente inactivo. Sin embargo, tanto en humanos, bovinos y otros mamíferos, queda una fracción de histonas asociadas al DNA, las cuales han sido atribuidas como partícipes en el imprinting génico. La alteración, tanto en la localización como en las características de éstas histonas, se han asociado a diversos tipos de infertilidad, definiéndose como uno de los prerequisitos para la capacidad fértil del espermatozoide.
A partir de estos antecedentes se plantea la siguiente hipótesis: En potros con óptimos parámetros seminales post descongelación, pero baja fertilidad, existe una integridad nuclear anormal, la cual compromete la función espermática.
Para evaluar esta hipótesis, se buscaron y seleccionaron dos grupos de potros, cuyo semen post-descongelación, para ambos grupos, tuvieran valores de parámetros de análisis seminal normales, considerando el análisis clásico (morfología, integridad de membrana y motilidad) y avanzado (estado acrosomal, peroxidación lipídica, estado de capacitación y activación de caspasas). Sin embargo, al usar su semen, se observaban niveles bajos en la tasa de gestación a los 15 días post inseminación.
Con ambos grupos ya identificados se analizaron: el estado de fragmentación y compactación de la cromatina nuclear, alteraciones en la localización de protaminas (1 y 2) e histonas (H3, H4 acetilada en lisina 12) y alteraciones en la asociación de histonas y/o protaminas con determinadas secuencias de genes, documentadas como referencia en humanos ya que en equinos no existe información, participantes en el desarrollo embrionario (PLXNA, BRDT, NSD, MECP2 y PHF7).
Entre ambos grupos no se observaron diferencias significativas respecto a la fragmentación de la cromatina nuclear, sin embargo, si se encontraron al evaluar la compactación. Al evaluar la localización de protaminas e histonas, no se encontró un patrón nuclear definido que pudiera entregar información sobre la diferencia entre los grupos. Finalmente, al analizar diferencias en la asociación de histonas y protaminas con secuencias asociadas a genes de desarrollo embrionario, no se encontraron diferencias significativas en una primera aproximación, usando como análisis el test Kruskal-Wallis. Para un segundo análisis de los datos, se ajustaron modelos estadísticos de regresión logística para establecer que secuencias asociadas a histonas o protaminas podían ser usadas para la predicción de la fertilidad o sub-fertilidad, destacando las secuencias asociadas a los genes NSD, PHF7 y protamina P1, las cuales permitieron predecir la sub-fertilidad con una exactitud de un 77,78%, 66,67% y 77,78% respectivamente. Sin embargo, la predicción de fertilidad con estas secuencias presentó un bajo acierto, con un 47,06% tanto para NSD y protamina P1. Con esta información podemos concluir que existe una mayor incertidumbre para su predicción. Estos resultados nos permiten visualizar un potencial uso de estos marcadores, sin embargo, se necesita mejorar la sensibilidad asociada a la técnica, considerando que, por ejemplo, las secuencias utilizadas eran referencia de lo observado en humanos.
Estos resultados sugieren la importancia de enriquecer la evaluación de la calidad espermática de potros con el análisis de la compactación nuclear. A su vez, entregan información sobre el potencial uso de marcadores de imprinting génico asociado a alteraciones en la fertilidad en equinos. | |
| dc.description | Historically, stallion fertility potential has been analyzed by sperm concentration, motility, and morphology when assessing semen quality. Of these measured parameters, motility has been used as a gold standard to evaluate semen. However, none of them is necessarily related to fertility potential.
In horses, there does not exist any one test that consistently predicts the fertilizing capacity of semen. However, values as vitality, motility, DNA fragmentation and morphology, among others, have been used as sperm quality evaluation, both in fresh and cryopreserved samples, considering as important information for their use.
When none of these parameters allow to explain the sub-fertility or infertility of mammals, and plasma membrane alterations have been discarded, a new approach is described related to ”normal” nuclear status that could be related to fertility outcome. This is the case of a group of stallions, specifically post-thawing their semen, in which the classical parameters cannot differentiate between which animal exhibits higher or lower levels of fertility, resulting in low pregnancy index, or failure in early embryo development.
In the nuclei of stallion sperm, as well as in other mammals, protamines, highly basic proteins, replace almost all the DNA bounded histones in late spermatogenesis. As protamines are positively charged, they have an extreme affinity to the negatively charged DNA backbone, which allows to conform a highly and transcriptionally inactive nuclei. However, alterations in genomic imprinting are associated to infertility of mammals such as mice, rats and humans, being now considered (among other parameters), prerequisites for adequate fertility status.
From this background it was suggested the hypothesis that in stallions with optimal seminal parameters but low fertility, there is an abnormal nuclear integrity which compromises sperm function
To evaluate this hypothesis, we first searched and selected two groups of donors stallion, which possessed normal semen parameters post-thawing, considering classic semen parameters (morphology, membrane integrity and motility) and advanced (acrosomal state, lipid peroxidation, capacitation state and caspase activation), but with differences in their pregnancy rate evaluated 15-day post insemination.
With both groups defined, were analyzed the following parameters: nuclear fragmentation and compaction state, alteration in localization of protamine (both 1 and 2) and histones (H3, H4 acetylated in lysine 12), and, alteration in association between those proteins and sequences of gene involved in embryo development (PLXNA, BRDT, NSD, MECP2 y PHF7) described in other mammals (humans and bovines), due the lack of information in stallions.
There was no differences among both groups in chromatin fragmentation, however, we had differences when chromatin compaction was evaluated. Nuclear localization of protamines did not shown any differences between groups, being heterogeneous.
Finally, no significant differences were found in the association of histones and protamines to sequences of embryonic development gene. were analyzed. A more complex statistical analysis was developed, using statistical logistic regression models, which were adjusted to establish both histones, protamines or sequences were contributing most significantly in predicting fertility or sub-fertility, being the most promising sequences associated to NSD, PHF7 and P1 protamine, which allowed us to predict a sub-fertility with an 77.78%, 66.67% and 77.78% of accuracy respectively. However, fertility prediction was much more variable, corresponding to 47.06% for both P1 protamine NSD and therefore more uncertainty prediction. These results seems promising considering that may provide support for improvement of techniques related to these markers used particularly in horses.
These results suggest the importance of analyzing the nuclear compaction in seminal analysis of foals, which allow to us group differences problems and its potential relationship with sequences of imprinted genes, whose studies should be expanded for potential use as biomarkers of fertility problems in foals. | |
| dc.description | PFCHA-Becas | |
| dc.description | PFCHA-Becas | |
| dc.format | application/pdf | |
| dc.relation | instname: Conicyt | |
| dc.relation | reponame: Repositorio Digital RI2.0 | |
| dc.relation | info:eu-repo/grantAgreement//21120861 | |
| dc.relation | info:eu-repo/semantics/dataset/hdl.handle.net/10533/93488 | |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | |
| dc.rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile | |
| dc.rights | info:eu-repo/semantics/openAccess | |
| dc.rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ | |
| dc.subject | Ciencias Agrícolas | |
| dc.title | Cambios nucleares en espermatozoides equinos y su relación con la fertilidad | |
| dc.type | Tesis Doctorado | |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis | |
| dc.type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion | |
| dc.type | Tesis | |
