Tesis Doctorado
Rol de la microbiota del jugo gástrico en la respuesta inmune innata de mucosa en la infección pediátrica por H. pylori
Role of gastric juice microbiota in the mucosal innate immune response in pediatric H. pylori infection
Autor
Hernández-Vargas, Caroll Daffner
Institución
Resumen
Helicobacter pylori (H. pylori) es una bacteria colonizadora del estómago humano, cuya adquisición temprana en la niñez, está asociada con una modificación en la composición de la microbiota del estómago. Esta tesis estudió el rol de la microbiota del jugo gástrico de niños infectados y no infectados con H. pylori sobre la estructura y función inmune innata que ocurre a nivel de la barrera de células epiteliales gástricas, planteando como hipótesis que la microbiota del jugo gástrico de niños infectados con H. pylori, altera la integridad de la barrera y la respuesta inmune de las células epiteliales gástricas.
Se utilizaron cultivos in vitro de la línea celular gástrica AGS y un cultivo primario de monocapas de células epiteliales diferenciadas de stem cells de organoides gástricos pediátricos, los cuales fueron estimulados con el jugo gástrico de niños infectados y no infectados con H. pylori. En estos dos modelos se evaluó los posibles sitios de acción de la microbiota, como los receptores tipo TLRs, proteínas formadoras de uniones estrechas y el efecto sobre factores inmunes como citoquinas y β-defensinas. Adicionalmente, en el cultivo de monocapa de células epiteliales diferenciadas de organoides, se evaluó distintos patrones de distribución de la proteína formadora de unión estrecha zónula ocludens 1 (ZO-1), que incluyeron quiebres en la estructura de la barrera de células epiteliales, inmuno-tinción de ZO-1 difusa, débil, puntiforme y formación de estructuras en forma de anillos. También, en este modelo se estudió la primo infección por H. pylori por medio de un ensayo de desafío con la bacteria en células pre-incubadas con la microbiota del jugo gástrico de niños no infectados, evaluando el efecto sobre los patrones de distribución de ZO-1.
En el modelo de células AGS, se encontró que el jugo gástrico de niños no infectados indujo una disminución de la expresión de mRNA de claudina-2 (Cldn-2) y de la β-defensina-1 (hBD-1) en comparación a las células sin tratar. Por otro lado, el jugo gástrico de niños infectados con H. pylori produjo un aumento de la expresión de mRNA del receptor TLR-2. Tanto en células AGS como en monocapa de células epiteliales el jugo gástrico ejerció un aumento en la secreción de IL-8 y TNF-α de manera dependiente de la presencia del componente bacteriano e independiente del estatus de infección por H. pylori. En las monocapas de células epiteliales, la microbiota del jugo gástrico de ambos grupos, indujo la expresión de la β-defensina-2 (hBD-2), mientras que el jugo gástrico de niños infectados con H. pylori indujo la expresión de IL-8 y TNF-α y un aumento en el porcentaje de células que presentan estructuras en forma de anillo de ZO-1, lo cual es dependiente de la presencia del componente bacteriano. El análisis de las estructuras en forma de anillo de ZO-1, sugirió la formación de un poro entre la unión célula-célula, lo cual podría modificar la función de la barrera de células epiteliales.
Finalmente, el ensayo de primo-infección por H. pylori mostró que el jugo gástrico de niños no infectados disminuye la alteración estructural de la barrera de célula epiteliales producida por infección temprana de H. pylori.
En conclusión, la microbiota del jugo gástrico de niños sanos previene el efecto inducido por la infección temprana por H. pylori, estimulando la respuesta inmune innata y disminuyendo la alteración estructural de la barrera de célula epiteliales. Sin embargo, si los mecanismos de defensa son sobrepasados y se establece la infección por H. pylori, la microbiota del jugo gástrico asociada a la infección estimula la respuesta inmune innata para hacerla más efectiva, pero altera la integridad de la barrera de las células epiteliales gástricas, lo que podría tener un rol en el daño asociado a la infección. De este modo, el jugo gástrico de niños no infectados por H. pylori, podría ser un posible blanco terapéutico para modular la respuesta inmune y disminuir alteraciones en la estructura de la barrera en las células epiteliales gástricas en presencia de H. pylori, sin la necesidad de erradicar la bacteria de su nicho. Helicobacter pylori (H. pylori) is a colonizing bacterium of the human stomach. Early childhood acquisition is associated with a change in composition of the stomach microbiota. This thesis studied the role of the microbiota of gastric juice from infected and uninfected children with H. pylori on the structure and immune function that occurs at the level of the gastric epithelial cell barrier. Our hypothesis is that the microbiota of the gastric juice from infected children, alters the integrity of the barrier and the immune response of gastric epithelial cells.
AGS gastric cell line and a primary culture of epithelial gastric cells monolayers differentiated from stem cells of gastric organoids from pediatric patients were used. Both cultures were stimulated with the gastric juice from infected children and infected with H. pylori. In both models, we evaluated the possible sites of action of the microbiota, like the TLRs type receptors, tight junction proteins and the effect on immune factors such as cytokines and β-defensins.
Additionally, we evaluated the different patterns of distribution of the tight junction protein zonule ocludens 1 (ZO-1) in epithelial cells monolayer differentiated from gastric organoids. We described different pattern of distribution of ZO-1 which included breaks in the structure of the barrier epithelial cells, immuno-staining of diffuse, weak, punctate and formation of structures in the form of rings.
Also, in this model the primary infection by H. pylori was studied through of a challenge test. We pre-incubated the monolayer with the gastric juice microbiota from uninfected children and then was infected with H. pylori. In this assay we evaluated the effect on distribution patterns of ZO-1.
In the AGS cells model, it was found that the gastric juice from uninfected children induced a decrease in mRNA expression of claudin-2 (Cldn-2) and β-defensin-1 (hBD-1) compared to untreated cells. On the other hand, the gastric juice from infected children produced an increase in TLR2 mRNA expression. In AGS cells and monolayer of epithelial cells, the gastric juice exerted an increase in the secretion of IL-8 and TNF-α dependent of bacterial presence and independent of the status of H. pylori infection.
In epithelial cells monolayers, the gastric juice microbiota in both groups, induced the expression of β-defensin-2 (hBD-2), whereas the gastric juice from infected children induced the expression of IL-8 and TNF-α and an increase in the percentage of cells that have ring-like structures ZO-1, which is dependent on the presence of the bacterial component. The analysis of the ring-shaped structures of ZO-1, suggested the formation of a pore between the cell-cell binding, which could modify the function of the cell barrier epithelial.
Finally, the primary H. pylori infection test showed that the gastric juice from uninfected children decreases the structural alteration in the epithelial cell barrier produced by early H. pylori infection.
In conclusion, the microbiota of the gastric juice of healthy children prevents the induced effect by early H. pylori infection, stimulating the innate immune response and decreasing the structural alteration of the epithelial cell barrier. However, if the defense mechanisms are exceeded and H. pylori infection is established, the gastric juice microbiota associated with the infection stimulates the innate immune response to make it more effective, but it alters the integrity of the epithelial gastric cell barrier, which could have a role in the damage associated with the infection. In this way, the gastric juice from uninfected children, could be a possible target therapy to modulate the immune response and decrease alterations in the structure of the barrier in gastric epithelial cells in the presence of H. pylori, without the need to eradicate the bacteria from your niche. PFCHA-Becas PFCHA-Becas