Tesis Doctorado
Influencia de las o-glicosilaciónes sobre la velocidad de hidratación y estructura de mucinas respiratorias.
Autor
Espinosa-De La Fuente, Marisol
Institución
Resumen
El moco es un gel polimérico e hidrofílico que cubre diversas superficies epiteliales y
es parte del mecanismo de defensa innato presente en el tracto respiratorio humano.
Las diversas partículas inhaladas y agentes patógenos que quedan atrapados en
éste, son eliminados a través del transporte mucociliar ("clearence" mucociliar). El
moco, está formado por una matriz polimérica (1%), agua (95%) y también iones y
otras proteínas (2%). La matriz polimérica está formada principalmente por mucinas
que pertenecen a una familia de glicoproteínas polianiónicas de alto peso molecular
(2-30 MDa), que se caracterizan por tener un alto contenido de azúcares O-ligados al
eje de proteína. Dos tipos principales de mucinas secretadas han sido descritas en el
moco respiratorio humano; MUC5AC y MUC513. Las mucinas son liberadas al medio
extracelular mediante exocitosis y forman un hidrogel (mucus gel) sólo después de
su hidratación. Las características fisicoquímicas de las mucinas, como también la
forma en que se interconectan unas con otras en solución, son factores
determinantes de la viscosidad del moco. Sin embargo, escasos son los estudios que
relacionan el contenido de O-oligosacáridos de las mucinas, tanto con la velocidad
de hidratación de ellas, como con el contenido de estructura secundaria de la matriz
polimérica de mucinas. Estudios realizados en moco respiratorio proveniente de
pacientes con patologías respiratorias hipersecretorias (fibrosis qu ística, asma
bronquial y bronquitis obstructiva), han mostrado que la estructura glicosilada de las
mucinas presenta mayor grado de sulfatación, fucosilación y sialilación con respecto
a personas sanas. Estos cambios moleculares contribuyen al aumento en la
adhesión de bacterias al moco y al aumento de la viscosidad del moco, con un
concomitante deterioro en la eficiencia del clearence mucociliar. Estos antecedentes
permitieron proponer que "Las O-glicosilaciones determinan la estructura secundaria
de las mucinas y afecta la velocidad de hidratación de la matriz granular durante la
exocitosis". Se desarrolló un protocolo de cultivo celular, que permitió obtener células
del epitelio respiratorio, particularmente del tipo mucosecretor. A partir de este
modelo biológico, se determinó el efecto de la inhibición de la 0-glicosilación (con
Benzil-GalNAc 0,2 y 2 mM, por 24 h), sobre la síntesis y liberación de mucinas. Se realizó la purificación de MUC5AC, a través de sedimentación al equilibrio y
sedimentación por velocidad en medios condicionados controles y post tratamiento
con Benzil-GaINAc. Además, se comparó la velocidad de hidratación de la matriz de
gránulos secretorios en presencia y ausencia de O-oligosacáridos. Finalmente, se
determinó el contenido de estructura secundaria de la mucina MUC5AC 0-glicosilada
y desglicosilada. La técnica de cultivo utilizada permitió obtener células que
expresaron y secretaron principalmente la mucina MUC5AC en dos formas,
glicosilada y desgilcosilada. La inhibición de la O-glicosilación, redujo
dramáticamente la secreción de MUC5AC glicosilada y también aumentó el
coeficiente de difusión de los gránulos secretados post tratamiento con BenzilGaINAc
2mM. Estos antecedentes demuestran que la 0-glicosilación determina el
estado oligomérico de la mucina MUC5AC, aumenta el coeficiente de difusión de la
matriz granular de gránulos exocitados en cultivo y probablemente modifica la
estructura secundaria de las mucinas secretadas. Todos estos antecedentes
sugieren que el contenido de carbohidratos O-ligados a las mucinas, podrían
determinar los cambios en las propiedades visco-elásticas del mucus respiratorio, a
través de su participación en la determinación del estado oligomérico de las mucinas
secretadas. Los resultados apoyan la importancia de los carbohidratos O-ligados a la
configuración de la matriz del moco y contribuyen a explicar las alteraciones
patológicas del moco en cuadros respiratorios hipersecretorios. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Biomédicas 161p. PFCHA-Becas TERMINADA