Thesis
La extracción del colesterol membranal altera la respuesta de contracción inducida por 5-HT y la histamina en el músculo liso traqueal de bovino: papel de la caveola y la Rho cinasa
Fecha
2012-06-22Registro en:
Sommer Cervantes, María Eugenia Betina. (2010). La extracción del colesterol membranal altera la respuesta de contracción inducida por 5-HT y la histamina en el músculo liso traqueal de bovino: papel de la caveola y la Rho cinasa (Doctorado en Investigación en Medicina). Instituto Politécnico Nacional, Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, Escuela Superior de Medicina, México.
Autor
Sommer Cervantes, María Eugenia Betina
Institución
Resumen
RESUMEN: Las balsas lipídicas y las caveolas membranales son plataformas de transducción de señales. Algunos receptores y moléculas de señalización como la cinasa de Rho (ROCK) han sido encontrados en las caveolas del músculo liso. Este estudio determinó si la función de los receptores H1 y 5-HT2A y los canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC) se modifica por la alteración de las caveolas y si esa modificación se debe al ensamblado inadecuado de la vía de señalización intracelular RhoA/ROCK. El tratamiento del músculo liso de tráquea de bovino (MLVA) con metil β-ciclodextrina (MβCD), usado para disminuir el contenido de colesterol membranal y deformar a las caveolas, disminuyó las contracciones sostenidas inducidas por histamina (80%), 5-HT (100%), α-metil 5- HT (100%) y KCl (30%). La reconstitución del colesterol membranal con MβCD cargada con colesterol (CL- MβCD) restableció parcialmente las respuestas a los agonistas, y completamente la respuesta a KCl. La inhibición de ROCK con Y27632, también disminuyó la contracción por histamina (85%), 5-HT (59 %) y KCl (~30%). La actividad de ROCK, evaluada a través de Western blots, aumentó después de la estimulación con 5-HT o histamina; estos incrementos se redujeron con MβCD y se restablecieron parcialmente con CL- MβCD. La presencia en el MLVA de caveolina-1 (Cav-1), H1, 5-HT2A y ROCK1 se corroboró por inmunoblots de fracciones membranales, microscopía confocal e inmunoprecipitación. Los receptores H1 co-inmunoprecipitaron con Cav-1 en las fracciones membranales caveolares y no caveolares, mientras que los receptores 5HT2A se identificaron en las fracciones no caveolares. En conclusión, la integridad de las caveolas y del contenido membranal de colesterol son indispensables para el correcto funcionamiento de H1, 5HT2A y VDCC a través de la vía de señalización Rho/ROCK. ABSTRACT: Membranal lipid rafts and caveolar domains are signal transduction platforms. In smooth muscle, some receptors and signalling molecules as Rho-kinase (ROCK) have been localized in caveolae. This study was aimed to find out, in bovine tracheal smooth muscle (BTSM), if functions of H1 and 5-HT2A receptors, and voltage dependent Ca2+ channels (VDCC) were modified by caveolae disruption and if those alterations were due to an inadequate coupling to the RhoA/ROCK signaling pathway. Methyl-β-cyclodextrin (MβCD) treatment, used to deplete membrane cholesterol and disrupt caveolae, diminished sustained contractions to histamine (80%), 5-HT (100%), α-methyl 5-HT (100%) and KCl (30%). Cholesterol restitution through cholesterol loaded MβCD (CL- MβCD), partially restored the responses to the agonists, but completely restituted the KCl induced contraction. ROCK inhibition through Y-27632, also diminished contractions to histamine (85%), 5-HT (59 %) and KCl (~30%). ROCK activity measured through Western Blot augmented after 5-HT or histamine stimulation, and these agonistinduced increases were lowered by MβCD and partially re-established by CLMβCD. The presence of Caveolin-1 (Cav-1), H1, 5-HT2A, and ROCK1 in BTSM were corroborated by immunoblotting of membrane fractions from sucrose gradients, confocal microscopy and co-inmmunoprecipitation. H1 receptors coimmunoprecipitated with Cav-1 in caveolar and non-caveolar membrane fractions, while 5HT2A receptors appeard to be in non-caveolar membrane fractions. The conclution is that caveolar and cholesterol integrity are indispensable for the proper functionality of the H1, 5HT2A and VDCC through their Rho/ROCK signaling.