Detección molecular e intento de aislamiento del virus de la bronquitis infecciosa aviar (coronavirus) en explotaciones avícolas del departamento de Cundinamarca

Abstract

Currently the Colombia's poultry industry faces a problem in terms of respiratory diseases, because many timers it is not known for sure which is the primary cause of the disease, as there are various infectious agents involved that fail to be identified for different reasons . In this sense, the avian infectious bronchitis virus (AIBV), is one of the most important viral agents involved in the respiratory complex disease in birds. It is a problem given the economic consequences that causes, which are represented in fatalities, low performance, as well as the exacerbation of bacterial diseases that leads to prolonged treatments. The causative agent is the virus of AIB that belongs to the coronavirus genus, Coronaviridae family and order Nidovirales. It is an acute disease, characterized by high morbidity, and respiratory, reproductive, renal and digestive system problems. There are a great diversity of serotypes generated by genetic modification given its characteristics of viral replication. Among the best known serotypes are Massachusetts, Arkansas, Connecticut and Delaware. The application and development of appropriate diagnostic methods for the identification of viruses added importance. A method like the RT-PCR is used in diagnostics because it allows the differentiation between strains including variants serotypes. Considering this, the main focus of the study was to determine the presence of AIBV in commercial birds suffering from respiratory disease. In order to achieve this goal tissue samples from 14 farms (10 broilers, 2 layers and 2 breeders) located in Cundinamarca were analyzed. At the necropsy samples from cecal tonsils, kidney, lung, trachea and tracheal swabs were collected and used for viral isolation in SPF chicken embryo eggs. Positive samples were analyzed by RT- PCR, targeting the S1 gene, and further sequencing of the replicates was conducted and the results used for phylogenetic analysis. As a result, AIB virus was isolated from trachea, kidney and tracheal swabs from birds in 6 farms. When compared with strains available in the Genbank, 99 to 92% similairy was found. Phylogenetic analyzed showed greater identity with M41, H120, QX(D388), Egypt strains and to a lesser degree of identity but with bootstrap higher than 90% with Beaudette, JMK, D532/9 y Omnan/BI strains, demonstrating the presence of various AIBV circulating in the population under study. Keywords: RT-PCR, isolation, embryonated eggs, sequencing, phylogenetic relationship.

Actualmente en Colombia la industria avícola enfrenta una problemática importante en cuanto a enfermedades respiratorias se refiere, pues no se conoce cuál es la causa primaria del cuadro clínico respiratorio presentado, ya que están involucrados diversos agentes infecciosos que no logran ser identificados a nivel de campo. En este sentido, el virus de la bronquitis infecciosa aviar (BIA), cobra gran relevancia ya que es uno de los principales agentes virales involucrado en el complejo de enfermedades respiratorias en las aves, teniendo un impacto económico importante ya que ocasiona pérdidas, las cuales están representadas en tasas de mortalidad aumentadas, bajos rendimientos zootécnicos, así como la exacerbación de enfermedades bacterianas lo que conlleva a tratamientos prolongados. El agente etiológico es el virus de la BIA, perteneciente al género coronavirus, familia coronaviridae, orden Nidovirales. La enfermedad es de curso agudo, presenta una alta morbilidad y manifestaciones clínicas a nivel del sistema respiratorio, reproductivo, renal y digestivo. El virus posee una gran diversidad de serotipos generados por modificaciones genéticas dadas sus características de replicación viral. Entre los serotipos más conocidos se encuentran Massachusetts, Arkansas, Connecticut y Delaware. La aplicación y desarrollo de métodos de diagnóstico adecuados para la identificación y diferenciación del virus son por tanto de gran importancia. En este sentido el empleo de métodos como el de RT-PCR, cobra gran relevancia ya que permite diferenciar serotipos conocidos incluyendo cepas variantes. Teniendo en cuenta lo anterior, el principal objetivo de este estudio fue determinar la presencia del VBIA, en aves comerciales que presentaban cuadros respiratorios y establecer la participación de variantes del virus. Con este fin se realizó la secuenciación en explotaciones avícolas del Departamento de Cundinamarca de productos de amplificación obtenidos a partir de RT-PCR (Transcriptasa reversa – Reacción en cadena de la Polimerasa), en las muestras de tejidos provenientes de aves de 14 granjas (10 de engorde, 2 de ponedoras, 2 de Reproductoras) distribuidas en el Departamento de Cundinamarca. Se evaluaron los tejidos obtenidos en la necropsia de las aves con sintomatología compatible con la enfermedad, los cuales incluyeron tonsilas cecales, riñón, pulmón, tráquea e hisopos traqueales, a partir de los cuales se realizó intento de aislamiento viral por inoculación en huevos embrionados SPF. Se evaluaron los tejidos por RT-PCR para una porción del gen S1 y las muestras positivas fueron procesadas para ser caracterizadas por secuenciación de nucleótidos. Como resultado se logró el aislamiento del virus de BIA a partir de muestras de tráquea, riñón e hisopos traqueales de seis (6) granjas. Al ser comparadas las secuencias obtenidas a partir de las cepas aisladas con aquellas reportadas en el Genbank se encontraron similitudes del 99% al 92%. El análisis filogenético mostró mayor identidad con cepas M41, H120, QX(D388), Egypt y en menor grado pero con un bootstrap mayor a 90% con cepas Beaudette, JMK, D532/9 y Omnan/BI, mostrando así la presencia de diversos tipos del virus de BIA circulando en las explotaciones estudiadas. Palabras clave: RT-PCR, aislamiento, huevos embrionados, secuenciación, relación filogenética.