Determinación del potencial de migración y estimulación de angiogénesis in vitro de células madre mesenquimáticas derivadas de médula ósea y tejido adiposo fetal bovino

Abstract

Las células madres mesenquimáticas (MSC) se han caracterizado inicialmente por su potencial de autorenovación y diferenciación in vitro hacia linajes celulares mesodérmicos. Sin embargo; el potencial terapéutico de las MSC se basa principalmente en sus capacidades de migración y angiogénesis importantes para la regeneración tisular. El objetivo del presente estudio fue determinar los potenciales de migración y angiogénesis de las MSC derivadas de médula ósea (MSC-MO) y de tejido adiposo (MSC-TA) fetales bovinas. El ensayo de migración scratch se utilizó para determinar la capacidad migratoria de las MSC, utilizando fibroblastos (FB) fetales como controles biológicos. Para este ensayo se cultivaron 44 x 103 células/cm2 hasta alcanzar 80% de confluencia. Luego de 24 horas, se realizó el scratch en la monocapa de cada línea celular y el área de migración fue cuantificada en el tiempo 0 y luego de 24 horas mediante el software ImageJ. El análisis de migración transwell, se utilizó para determinar el potencial de migración celular en respuesta al quimiotáctico factor derivado de células estromales-1 (SDF-1). Para este análisis se cultivaron 25x103 células/mL por 24 horas, en respuesta a SDF-1 ulilizando 5% suero fetal bovino (SFB) y medio DMEM como controles. Las células que migraron hacia el lado inferior de la membrana transwell fueron observadas y cuantificadas mediante el software ImageJ. Para el análisis del potencial angiogénico de MSC, se realizó el ensayo de formación de túbulos. Células endoteliales de aorta bovina fetal fueron aisladas y resuspendidas en medios condicionados de MSC-MO, MSC-TA y FB. Luego de 6 horas de incubación a 38°C en 5% CO2 se observó y cuantificó la formación de estructuras tubulares utilizando el software ImageJ. La expresión de genes de migración, SDF-1, su receptor CXCR4 y la quimiocina secretada y expresada por linfocitos T normales regulada por activación (RANTES) y de genes de angiogénesis, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiopoyetina 1 (ANGPT1) fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). Los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente por ANOVA de una vía y para las diferencias entre los promedios se utilizó el post test de tuckey, utilizando el software InfoStat. Mediante ensayo scratch se determinó un mayor (p<0,05) porcentaje de migración in vitro en cultivos de MSC-MO comparado con FB. Sin embargo; los porcentajes de migración no fueron distintos (p>0,05) entre MSC-MO y MSC-TA. El ensayo transwell permitió determinar un mayor (p<0,05) número de células migrantes en cultivos tratados con DMEM suplementado con 5% de SFB. Sin embargo; no se detectaron diferencias significativas entre líneas celulares. Se determinó que los niveles de mRNA de SDF-1 fueron mayores (p<0,05) en MSC-TA comparado con MSC-MO y FB. Los niveles de mRNA de RANTES fueron mayores (p<0,05) en MSC-TA comparado con FB. Sin embargo; los niveles de mRNA de CXCR4 no fueron distintos (p>0,05) entre las líneas celulares en estudio. El medio condicionado concentrado de MSC-TA indujo mayor (p<0,05) formación de túbulos, comparado con MSC-MO, FB y sus controles DMEM con 5% de SFB y DMEM. Además, se cuantificó una mayor (P<0,05) expresión de VEGF en MSC-TA comparado con las otras líneas celulares. En comparación, la expresion de ANGPT1 fue mayor (p<0,05) en MSC-MO y FB comparado con MSC-TA. En conclusión, el potencial de migración entre MSC-MO y MSC-TA es similar, lo cual puede estar determinado por niveles de expresión similares del receptor CXCR4. A su vez, una mayor expresión de VEGF en MSC-TA puede determinar que estas células presenten una mayor capacidad angiogénica comparado con MSC-MO.

Mesenchymal stem cells (MSCs) were initially characterized by their potential for self-renewal and in vitro differentiation into mesodermal cell lines. However, the therapeutic potential of MSCs is primarily based on their migration and angiogenic capacities, which are important for tissue regeneration. The objective of the present study was to determine the migration and angiogenic potentials of MSCs derived from bone marrow (MSC-MO) and adipose fetal bovine tissue (MSC-TA). The scratch migration assay was used to determine the migratory capacity of MSC, using fetal fibroblasts (FB) as biological controls. For this, 44 x 103 cells/cm2 were cultured until 80% confluence. After 24 hours, the scratch was performed in the monolayer of each cell line culture and the migration area was quantified at time 0 and after 24 hours using ImageJ software. The transwell migration analysis was used to determine cell migration capacity in response to the chemokine stromal differentiation factor-1 (SDF-1). For this assay, 25x103 cells/mL were grown for 24 hours in response to SDF-1, using as SFB 5% and DMEM as controls. Cells that migrated to the underside of the transwell membrane were observed and quantified using the ImageJ software. In order to determine the angiogenic potential of MSC, the tubule formation test was performed. Endothelial cells of bovine aorta were isolated and resuspended in conditioned media of each cell line. After 6 hours of incubation, the number of tubular structures was quantified and analyzed using ImageJ software. The relative expression levels of migration genes SDF-1, its receptor CXR4, regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted (RANTES) and angiogenic genes vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin (ANGPT1) were analyzed using quantitative-PCR (Q-PCR). The data obtained were statistically analyzed by one-way ANOVA and the tuckey post test was used to determine differences between means, using InfoStat software.The scratch test allowed to determine a higher (p<0.05) percentage of migration in MSC-MO cultures compared to FB. However, migration rates were not different (p>0.05) between MSC-MO and MSC-TA. The highest (p <0.05) number of migrant cells in the transwell test was detected in cultures treated with DMEM supplemented with 5% FBS. However, no significant differences were detected between cell lines. SDF-1 mRNA levels were higher (p <0.05) in MSC-TA compared to MSC-MO and FB. Similarly, RANTES mRNA levels were higher (p <0.05) in MSC -TA compared to FB. CXCR4 mRNA levels were not different (p> 0.05) between cell lines. Concentrated conditioned (CC) media of MSC-TA induced greater (p <0.05) tubule formation, compared to CC of MSC-MO, FB and its controls. Moreover, the highest (P <0.05) expression of VEGF was observed in MSC-TA, compared to the other cell lines. In the case of the expression of ANGPT1 the expression was higher in MSC-MO and FB compared to MSC-TA. In conclusión, a similar migration potential between MSC-MO and MSC-TA may be associated to similar expression of the CXCR4 receptor. Moreover, higher expression of VEGF in MSC-TA may explain the greater angiogenic capacity of these cells compared to MSC-MO.