Tesis Doctorado
Participación de receptores tipo-lectina en la inmunogenicidad y en el efecto antitumoral de hemocianinas de moluscos en mamíferos
Autor
Becker, María Inés
Universidad de Chile
Institución
Resumen
Las hemocianinas de moluscos son glicoproteínas que generan una potente activación del sistema inmune de mamíferos direccionando la respuesta hacia un perfil inmunológico de tipoTh1, esto es una respuesta caracterizada por la activación de linfocitos T CD4+ y la secreción de IFN-?. Esta cualidad ha permitido su amplio uso en biomedicina y en biotecnología como proteínas transportadoras (carrier) para producir anticuerpos, como adyuvantes en el desarrollo de vacunas terapéuticas para ciertos canceres y como inmunoestimulantes no-específicos en laterapia contra el carcinoma superficial de vejiga. Las hemocianinas provenientes de los gastrópodos Megathura crenulata (KLH) y Concho/epas concho/epas (CCH) han sido las más utilizadas para estos fines. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares por los cuales dichas proteínas ejercen su efecto inmunológico son muy poco conocidos. En este sentido, KLH y CCH poseen una estructura cuaternaria diferente, sin embargo presentan estructuras oligosacáridas similares, rasgo que ha sido invocado ampliamente en la literatura para explicar el efecto antitumoral de KLH y de las hemocianinas en general, no obstante esta idea no ha sido experimentalmente abordada. Por esta razón, en esta tesis hipotetizamos que: las hemocianinas activan la respuesta innata a través de un receptor de tipo lectina localizado en células presentadoras de antígenos (APCs) generando así un ambiente de citoquinas proinflamatorias, que indirectamente potencian la respuesta adaptativa antitumoral.Es así, que el objetivo general del trabajo experimental estuvo destinado a estudiar la participación de los azúcares de las hemocianinas en la activación de células presentadoras de antígenos (APCs) y su contribución a la inmunogenicidad y la actividad antitumoral de estasproteínas. Para ello, se usaron tres hemocianinas modelo, a saber KLH, CCH y FLH, esta última descubierta recientemente en nuestro laboratorio, proveniente del gastrópodo Fissurellalatimarginata. Los objetivos específicos incluyeron: 1) Preparar hemocianinas desglicosiladas y caracterizarlas fisicoquimicamente. 2) Determinar la participación de un receptor de tipo lectina en la endocitosis de dichas proteínas por células dendríticas derivadas de médula ósea(BMDCs) cultivadas in vitro. 3) Analizar la contribución de los azúcares en la activación de BMDCs y macrófagos peritoneales y 4) Estudiar la participación de los azúcares en lainmunogenicidad y el efecto antitumoral de las hemocianinas usando por primera vez un modelo murino de melanoma, ya que numerosas vacunas terapéuticas usan hemocianina como carrierladyuvante de antígenos asociados (TAA) a dicho cáncer.Entre los principales resultados, se destacan los siguientes. Análisis con lectinas biotiniladas mostraron diferencias en la composición de azúcares entre las distintas hemocianinasempleadas. Por una parte, las hemocianinas provenientes de la familia Fissurellidae (KLH y FLH) poseen el disacárido Gal-(?1-3)-GaINAc que generalmente se encuentra en estructuras de tipo O-linked, y además ?-manosa terminal asociado a estructuras de tipo N-linked. En contraste, CCH sólo presentó en común con ellas el residuo ?-manosa terminal. Las hemocianinas fueron desglicosiladas a través de un procedimiento químico que utilizaperyodato de sodio con el cual se logró oxidar todos los carbohidratos, demostrándose al microscopio electrónico de transmisión (MET) que la estructura cuaternaria de las hemocianinasoxidadas fue similar a la nativa. Sin embargo, diversos análisis electroforéticos de las proteínasdesglicosiladas y tratadas con enzimas proteolíticas mostraron que este procedimiento además de remover los carbohidratos también generó cambios intra-moleculares en la proteína, debidoa la formación de bases de Schiff.Contrario a lo esperado, CCH desglicosilada (Ox-CCH) fue igualmente incorporada que su forma nativa por BMDCs, principalmente por macropinocitosis y en menor medida por vesículas recubiertas de clatrina. Ox-CCH presentó una mayor resistencia a ser proteolizada, ya sea in vitro o in vivo, acumulándose por mayor tiempo en estructuras de tipo endosomal y en lamembrana plasmática de BMDCs, fenómeno que además fue corroborado mediante Western blot, analizando el procesamiento de otro antígeno modelo como es ovoalbúmina (OVA). Estas características aumentaron significativamente su inmunogenicidad en comparación con laproteína nativa. A pesar de esto, la estimulación de BMDCs con CCH y Ox-CCH, in vitro, no indujo la expresión de marcadores de maduración (MHC-II, CD80, CD86 y CD40) hasta las 72 horas de tratamiento, ni promovió la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, a diferencia de FLH que si lo hizo, induciendo la secreción de IL-6, IL-23, IL-12p40 y TNF-?.La inmunogenicidad y antigenicidad de Ox-CCH fue superior a la de su forma nativa, sin embargo no se observó un efecto similar con Ox-KLH. Por otra parte, la capacidad de inmunoestimulación no-específica de las hemocianinas nativas, analizadas en el modelo murino de melanoma B16F10 mostraron que la terapias ya sea con CCH, KLH o FLH redujeronsignificativamente el volumen del tumor y aumentaron la sobrevida de los ratones, fenómeno que también se observó con Ox-CCH pero no con Ox-FLH. Al respecto y asombrosamente, la forma nativa de FLH demostró tener capacidades antitumorales significativamente superiores a CCH y KLH, hecho que motivó la búsqueda de los factores que dan cuenta de esta propiedad.Es así que estudios en desarrollo, sugieren fuertemente que la vía de señalización por la cual FLH promueve la secreción de citoquinas pro-inflamatorias depende casi exclusivamente de laquinasa spleen tyrosine kinase (syk), sugiriendo fuertemente la participación de algún receptor de lectina tipo-C.En conclusión, en esta tesis se demuestra que una de las causas de la inmunogenicidad de las hemocianinas de moluscos en mamíferos es su lento procesamiento por células presentadoras de antígeno y sorprendentemente, que hemocianinas diferentes pueden inducirvías de activación inmunológica diferentes, por el hecho que la eliminación de sus azúcares afecta diferencialmente sus propiedades inmunogénicas y antitumorales. Es así que postulamos que los componentes oligosacáridos de CCH y KLH no son determinantes ni en su inmunogenicidad ni en su efecto antitumoral no específico, a diferencia de lo observado en FLH,en que aunque la eliminación de sus componentes oligosacáridos no afectó su inmunogenicidad si fueron determinantes en sus superiores propiedades inmunoestimulantes no-específicas,abriendo así nuevas interrogantes sobre las propiedades estructurales que posee cada una de estas proteínas para activar la respuesta del sistema inmune.