Dissertação
Desenvolvimento de um meio quimicamente definido e avaliação do efeito de um peptídeo tóxico em drosophila melanogaster
Registro en:
RANGEL, Darlene Lopes. Desenvolvimento de um meio quimicamente definido e avaliação do efeito de um peptídeo tóxico em drosophila melanogaster. 2017. 46 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas). Universidade Federal do Pampa. Campus São Gabriel. São Gabriel. 2017.
Autor
Rangel, Darlene Lopes
Institución
Resumen
Ureases are nickel-dependent enzymes that catalyze the hydrolysis of urea
into ammonia and carbon dioxide and are involved in the bioavailability of nitrogen
and in defense mechanisms against predators and pathogens in plants. They are
present in plant, fungi and bacteria, but are not synthesized by animals. Canavalia
ensiformis, a leguminous plant, have three urease isoforms: JBURE-I, JBURE-II and
CNTX, being JBURE-I or just JBU the most abundant. The insecticidal activity of JBU
depends on the release of a peptide – Jaburetox (JBTX) – that is cleaved by the
insects cathepsins enzymes. JBTX have fungitoxic, entomotoxic, neurotoxic and
antimicrobial effects. The toxicity of JBTX was described for insects of the order
Lepidoptera, Blattodea e Hemiptera wich the neurotoxic effect is due to the binding of
the peptide to neuronal cells, increasing UDP-N-acetylglucosamine activity and
inhibiting nitric oxide synthase. It was also related that JBTX acts on the Malpighian
tubules of Rhodnius prolixus, inhibiting diuresis by altering the cGMP levels and
acting in the transmembrane potential. However, there are no investigations about
the toxicity in Drosophila melanogaster in the literature. D. melanogaster has been a
model organism for almost a century, showing a range of advantages such as short
life cycle, low mantaining costs, easy to handle, besides having its genome
sequenced e its proteins annotated, which makes proteomics approaches viable. In
this work, we aimed to stablish a chemically defined medium, as well as elect the
best additive for a better rate of oviposition. Also, we wanted to investigate how JBTX
acts on the central nervous system of D. melanogaster larvae. The chemically
defined medium that allowed the full development of the flies was the medium
composed only of agar, sucrose, yeast and methyl paraben, which fed the larvae of
D. melanogaster until they reached the adult stage. The additive with the best
oviposition rate was ethanol (5%), presenting approximately 700 eggs, unlike the
control that presented approximately 500 eggs and propionic acid (1%) with
approximately 200 eggs, thus demonstrating that an additive more similar to natural
habitat of oviposition is more attractive. One-dimensional electrophoresis was
performed to visualize significant changes in the electrophoretic profile of the central
nervous system of D. melanogaster larvae on the action of JBTX. However, due to an
aberrant electrophoresis, no quantitative or qualitative analysis of the proteins was
possible. to visualize the presence of proteins in the gel. Ureases são enzimas níquel-dependentes que catalisam a hidrólise da ureia
em amônia e dióxido de carbono e estão envolvidas na biodisponibilidade de
nitrogênio e em mecanismos de defesa contra predadores e patógenos em plantas.
Estão presentes em plantas, fungos e bactérias, mas não são sintetizadas por
animais. Canavalia ensiformis, uma leguminosa, apresenta três isoformas de
ureases: JBURE-I, JBURE-II e CNTX, sendo JBURE-I ou somente JBU (jack bean
urease) a mais abundante. A atividade inseticida de JBU depende da liberação de
um peptídeo - Jaburetox (JBTX) - cuja quebra é realizada por enzimas catepsinas
dos insetos. JBTX apresenta efeitos fungitóxicos, entomotóxicos, neurotóxicos e
antimicrobiano. A toxicidade de JBTX foi descrita para insetos das ordens
Lepidoptera, Blattodea e Hemiptera, cujo efeito neurotóxico se dá pela ligação do
peptídeo a células neuronais, aumentando a atividade de UDP-N-acetilglucosamina
pirofosforilase e inibindo a óxido nítrico sintase. Também é relatado que JBTX atua
sobre os túbulos de Malpighi de Rhodnius prolixus, inibindo a diurese por alterações
nos níveis de cGMP e no potencial transmembrana. Contudo, investigações acerca
da toxicidade em Drosophila melanogaster inexistem na literatura. D. melanogaster,
popularmente conhecida como mosca da fruta, é um organismo modelo por quase
um século, apresentando uma gama de vantagens como ciclo de vida curto, baixo
custo de manutenção, facilidade de manuseio, além de ter seu genoma sequenciado
e suas proteínas anotadas, viabilizando abordagens proteômicas. Neste trabalho
objetivamos estabelecer um meio quimicamente definido, bem como eleger qual o
melhor aditivo para uma maior taxa de oviposição. Também objetivamos investigar
como o JBTX age no sistema nervoso central de larvas de D. melanogaster. O meio
quimicamente definido que possibilitou o total desenvolvimento das moscas foi o
meio composto apenas de ágar, sacarose, fermento e metilparabeno, que nutriu as
larvas de D. melanogaster até estas atingirem o estágio adulto. O aditivo com a
melhor taxa de oviposição foi o etanol (5%), apresentando aproximadamente 700
ovos, diferentemente do controle que apresentou aproximadamente 500 ovos e do
ácido propiônico (1%) com aproximadamente 200 ovos, demonstrando assim que
um aditivo mais semelhante ao habitat natural de oviposição é mais atrativo.
Eletroforese unidimensional foi realizada para a visualização de mudanças
significativas no perfil eletroforético do sistema nervoso central de larvas de D.
melanogaster sobre a ação do JBTX, porém devido a uma eletroforese aberrante,
não foram possíveis análises quantitativas ou qualitativa das proteínas, porém foi
possível a visualizar a presença de proteínas no gel.