O vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o vírus da leucemia felina (FeLV) são retrovírus de grande importância para a medicina veterinária, já que acometem gatos selvagens e domésticos mundialmente. Por serem doenças que podem evoluir para quadros clínicos severos em pouco tempo, faz-se necessário o diagnóstico preciso e rápido, para que os animais tenham melhores opções terapêuticas. Os testes disponíveis no mercado, como o ELISA, são bons, porém não tão práticos e sensíveis o suficiente. Portanto, a qPCR e a RT-qPCR vieram para solucionar os problemas encontrados por outros métodos, proporcionando um diagnóstico prático, rápido e sensível. Levando em conta o advento da PCR em tempo real para a detecção do FIV e FeLV, este trabalho teve como objetivo desenvolver e padronizar conjuntos de primers e sondas para detecção singleplex e multiplex destes patógenos. Inicialmente foi feita uma pesquisa na ferramenta BLAST da NCBI para encontrar regiões de similaridade do genoma do RNA viral do FIV e do FeLV, para alinhamento dos primers. As regiões foram escolhidas de modo que não houvesse interferência com outras sequências genéticas, garantindo maior especificidade. A sonda escolhida foi a de hidrólise, pois garante maior especificidade e possibilidade de desenvolver sistemas de detecção multiplex. Foram feitos testes para determinar as condições de maior eficiência da reação, como: gradiente de temperatura, concentração dos primers e sondas e sensibilidade analítica. Foram avaliadas também a reprodutibilidade e repetibilidade para análise da precisão dos ensaios. Foi constatado que os conjuntos desenvolvidos apresentaram sensibilidade semelhante a kits disponíveis no mercado (aproximadamente 500 cópias por mL), e a variação entre os ensaios foi igual ou inferior a 5%, indicando que foram precisos. Sendo assim, os conjuntos de primers e sondas desenvolvidos foram validados com sucesso e apresentam boa eficiência, estando prontos para serem validados também com amostras biológicas. Palavras-chave: FIV, FeLV, PCR em tempo real, diagnóstico, felinos.Feline immunodeficiency virus (FIV) and feline leukemia virus (FeLV) are retroviruses of great importance to veterinary medicine, as they affect wild and domestic cats worldwide. As these are diseases that can progress to severe clinical conditions in a short time, an accurate and fast diagnosis is necessary, so that the animals have better therapeutic options. Tests available on the market, such as ELISA, are good, but not practical and sensitive enough. Therefore, qPCR and RT-qPCR emerged to solve the problems encountered by other methods, providing a practical, fast and sensitive diagnosis. Taking into account the advent of real-time PCR for the detection of FIV and FeLV, this work aimed to develop and standardize a set of primers and probes for singleplex and multiplex detection of these pathogens. Initially, a search was carried out using the NCBI BLAST tool to find regions of similarity in the genome of the viral RNA and the proviral DNA of both FIV and FeLV, for alignment of the primers. The regions were chosen so that there was no interference with other genetic sequences, ensuring greater specificity. The hydrolysis probe was chosen, as it guarantees greater specificity and the possibility of developing multiplex detection systems. Tests were carried out to determine the conditions of greater efficiency of the reaction, such as: temperature gradient, concentration of primers and probes and analytical sensitivity. Reproducibility and repeatability were also evaluated to analyze the accuracy of the tests. It was found that the set developed showed sensitivity similar to kits available on the market (approximately 500 copies per mL), and the variation between assays was equal to or less than 5%, indicating that they were accurate. Thus, the set of primers and probes developed were successfully validated and showed great efficiency, being ready to be validated also with biological samples. Keywords: FIV, FeLV, real-time PCR, diagnosis, felines.