Dissertação
Desenvolvimento e otimização de sistemas de expressão de proteínas recombinantes em capim-elefante e em tabaco
Autor
Paiva, Vívian Caiafa Ferreira
Institución
Resumen
Advancements in biotechnology combined with genetic improvement have
allowed more precise and controlled genetic modifications to obtain desirable traits in
organisms. Transgenic plants are an attractive option in agriculture and the
pharmaceutical industry, providing resistance to diseases and environmental stresses,
as well as enabling the production of recombinant proteins and therapeutically relevant
secondary metabolites. Elephant grass (Pennisetum purpureum Schumach syn.
Cenchrus purpureus Schumach) is a widely used grass with high potential for dry
matter production in dairy and beef cattle farming. However, insects with a high
potential for crop damage, such as pasture spittlebugs, can impact the grass's
productivity. The development of transgenic plants resistant to pests is a viable
alternative to overcome this issue. In this study, we aimed to obtain a regeneration
protocol for the transformation of elephant grass BRS Capiaçu for further application
in genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens. Meristem induction was
performed using different combinations of growth regulators 2,4-D, BAP, and TDZ,
resulting in 93% regeneration of multiple shoots induced over 28 days with a treatment
containing 0.1 mg.L-1 2.4-D and 2 mg.L-1 BAP, with a selection curve determined at 50
mg.L-1 kanamycin and a three-day pre-culture period. The regenerated shoots showed
suitable root and shoot development, linked to a kanamycin-based determination of
the selection curve. The second chapter of this document, our aim was to characterize
the transgene expression for the production of a recombinant single-chain antibody
scFAB-anti-IL1ß by obtaining stable homozygous lineages of Nicotiana benthamiana.
This antibody was synthesized due to its biological importance in inflammatory
diseases related to prolonged cytokine IL-1ß secretion. Thus, we intended to select N.
benthamiana lineages for stable production of scFAB-anti-IL-1ß. Seeds were sown in
plates containing MS medium with kanamycin and the presence of the scFAB-anti-IL1ß was assessed, with lines showing transgene rates between 48.59% for IL-
1ßT0P122 and 95.55% for IL-1ßT0P20. T1 seedlings from IL-1ßT0P20 plants were
subcultured and (i) compared with hemizygous T0 plants by the 2−ΔΔCt method, with
values normalized with the 18S endogenous gene, and (ii) subjected to protein
extraction and purification. The production of scFAB-anti-IL1ß by the T1 regenerants
showed an approximate yield of 474 µg per gram of fresh leaf mass. Analysis of qPCR
and RT-qPCR data showed the presence of lines with estimated values for two copies
of the transgene in the expected 2:1 ratio. However, homozygous individuals tended
to exhibit genetic silencing, with reduced transgene expression. Os avanços da biotecnologia atrelados ao melhoramento genético permitiram
modificações genéticas mais precisas e controladas para a obtenção de
características desejáveis nos organismos. Plantas transgênicas são uma opção
atrativa na agricultura e na indústria farmacêutica, fornecendo resistência a doenças
e a estresses ambientais, bem como permitindo a produção de proteínas
recombinantes e de metabólitos secundários de interesse terapêutico. O capimelefante (Pennisetum purpureum Schumach syn. Cenchrus purpureus Schumach) é
uma gramínea amplamente utilizada como forragem de elevado potencial de produção
de matéria seca na pecuária leiteira e de corte. Todavia, insetos de alto potencial de
danos às culturas, como as cigarrinhas das pastagens, podem impactar a
produtividade da gramínea. O desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes
às pragas é uma alternativa viável para contornar essa problemática. No presente
trabalho, objetivamos a obtenção de um protocolo de regeneração visando a
transformação de capim-elefante cultivar BRS Capiaçu via Agrobacterium
tumefaciens. Foi realizada a indução de gemas laterais em diferentes combinações
de reguladores de crescimento 2,4D, BAP e TDZ, com a obtenção de 93% de
regeneração de múltiplos brotos induzidos por 28 dias em tratamento contendo 0,1
mg.L-1 2.4-D e 2 mg. L-1 BAP, com curva de seleção determinada de 50 mg. L-1 de
Canamicina e três dias como período de pré-cultivo. Os brotos regenerados
apresentaram bom desenvolvimento radicular e de parte aérea e o tratamento com
canamicina permitiu determinação da curva de seleção. No segundo capítulo deste
documento, objetivamos caracterizar a expressão de transgene para a produção de
um anticorpo recombinante de cadeia simples scFAB-anti-IL1ß a partir da obtenção
de linhagens homozigotas estáveis de Nicotiana benthamiana. Este anticorpo foi
sintetizado devido à importância biológica em doenças inflamatórias relacionadas com
o aumento prolongado da citocina IL-1ß. Dessa forma, pretendemos a seleção de
linhagens de N. benthamiana para a produção estável do anticorpo scFAB-anti-IL1ß.
Para isso, sementes de plantas transgênicas foram avaliadas quanto à presença do
gene que expressa scFAB-anti-IL1ß em placas contendo meio MS com o agente de
seleção canamicina. As plantas transgênicas apresentaram taxas de germinação
entre 48,59% para o evento IL-1ßT0P22 e de 95,53% para o evento IL-1ßT0P20. As
plântulas T1 advindas do evento IL-1ßT0P20 foram subcultivadas e (i) comparadas
com plantas T0 hemizigotas pelo método 2−ΔΔCt
, com valores normalizados com gene
endógeno 18S rRNA e (ii) submetidas à extração e purificação de proteínas. A
produção de scFAB-anti-IL1ß pelas regenerantes T1 apresentou rendimento
aproximado de 474 µg por grama de folha fresca. Com análise dos dados do qPCR e
do RT-qPCR, verificou-se a presença de linhagens com valores estimados para duas
cópias para o transgene na proporção esperada de 2:1. Todavia, os indivíduos
tendenciaram ao silenciamento gênico, com redução na expressão do transgene.