Dissertação
Estabelecimento de metodologia de isolamento e cultivo primário de hepatócitos bovinos para estudos do efeito modulador da saliva do carrapato Rhipicephalus microplus sobre expressão de genes relacionados à imunidade inata
Autor
Vieira, Felipe de Oliveira
Institución
Resumen
Innate immunity is the body's first line of defense against injury and invasion of
microorganisms. The complement system plays a key role in mediating acquired and
innate responses in defense against microbial and parasitic infections. In cattle, the
response against tick infestations leads the innate immunity cells in the injured tissue to
produce pro-inflammatory cytokines, signaling the onset of a more specific response, such
as the production of acute-phase proteins (APPs). Approximately 80 to 90% of the plasma
components of complement and APPs are produced in the liver and released systemically
for the control of inflammatory reactions. There are well-established methods of isolation
and culture of hepatocytes for in vitro studies, as well as commercial lines for human and
murine, however for bovines there are no well-established methodologies for isolation of
hepatocytes or commercial cell lines available for cultivation of this subtype. The bovine
tick, Rhipicephalus microplus, is a parasite that causes great economic losses for the
world livestock. It is known that bovine breeds differ in tick resistance, with the Bos indicus
breeds being more resistant compared to the Bos taurus breeds. Since there are
differences in the production of complement and APP molecules among resistant and
susceptible ticks, this work aimed to establish a methodology for the primary isolation and
in vitro culture of bovine hepatocytes to verify the modulatory effect induced by the R.
microplus tick saliva on the expression of genes related to innate immunity, such as
complement factors (C1, C3, C4, C5, mannose binding lectin) and APPs (Alpha 1 acid
glicoprotein, haptoglobin e serum amyloid A). For this purpose, several protocols of
isolation and primary culture of hepatocytes were evaluated. We were able to establish the
methodology with high cellular viability, morphological features and quality of the genetic
material. Gene expression analysis suggested that hepatocytes cultured in vitro might be
losing the physiological features, since the expression of some genes was not detected in
cultured cells. Although the stimuli used as a positive control have upregulated the
expression of the SAA encoding gene, the same behavior has not been observed in
complement genes regulated by the same signaling pathway in murine model. In addition,
no significant difference was observed between breeds in the expression of the evaluated
genes against the stimuli of tick saliva and nuclear receptor modulating agent related to
the hepatic control of murine inflammation. Our results suggest that the primary isolation
and in vitro culture of bovine hepatocytes might be causing loss of function of these cells,
and further investigation is needed to better understand the physiological processes
performed by hepatocytes. A imunidade inata é a primeira linha de defesa do organismo contra lesões e invasões de
micro-organismos. O sistema complemento desempenha um papel importante na
mediação das respostas adquiridas e inatas na defesa contra infecções microbianas e
parasitárias. Em bovinos, a resposta contra infestações por carrapato faz com que células
da imunidade inata, residentes no tecido lesado, produzam citocinas pró-inflamatórias,
sinalizando para o início de uma resposta mais específica, como a produção de proteínas
de fase aguda (PFAs). Cerca de 80 a 90% dos componentes plasmáticos do
complemento e proteínas de fase aguda são produzidas no fígado e liberadas
sistemicamente para o controle de reações inflamatórias. Já existem metodologias bem
estabelecidas de isolamento e cultivo de hepatócitos para estudos in vitro, bem como
linhagens comerciais para humanos e murinos, no entanto para bovinos não existem
metodologias de isolamento de hepatócitos bem estabelecidas, nem linhagens comerciais
disponíveis para cultivo desse subtipo celular. O carrapato bovino, Rhipicephalus
microplus, é um parasito que provoca perdas econômicas para a pecuária mundial. É
sabido que raças bovinas diferem quanto à resistência ao carrapato, sendo as raças Bos
indicus mais resistentes em comparação com as raças Bos taurus. Visto que existem
diferenças na produção de moléculas do complemento e PFA entre bovinos resistentes e
susceptíveis ao carrapato, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia de
isolamento primário e cultivo in vitro de hepatócitos bovinos para verificar o efeito
modulador induzido pela saliva do carrapato R. microplus sobre a expressão de genes
relacionados à imunidade inata, tais como os fatores do complemento (C1, C3, C4, C5,
lectina ligante de manose) e proteínas de fase aguda (Alpha 1 glicoproteína ácida,
haptoglobina e amiloide sérica A). Para tal, foram avaliados diversos protocolos de
isolamento e cultivo primário de hepatócitos, onde foi estabelecida a metodologia com
maior viabilidade celular, qualidade morfológica e do material genético extraído. As
análises de expressão gênica sugeriram que o modelo de cultivo in vitro pode não estar
mantendo as características fisiológicas dos hepatócitos, visto que a expressão de alguns
genes estava mais baixa nas células cultivadas quando comparada ao tecido hepático
fresco. Embora os estímulos utilizados como controle positivo tenham regulado
positivamente a expressão do gene que codifica a SAA, o mesmo não foi observado nos
genes do complemento que são regulados pela mesma via de sinalização em murinos.
Além disso, não foi observada diferença significativa entre as raças na expressão dos
genes avaliados frente aos estímulos de saliva de carrapato e agente modulador de
receptor nuclear relacionado com o controle hepático de inflamação em murinos. Os
resultados obtidos sugerem que o isolamento primário e cultivo in vitro de hepatócitos
bovinos podem estar provocando perda de função destas células, sendo necessárias
maiores investigações em busca de melhor compreensão acerca dos processos
fisiológicos desempenhados pelos hepatócitos.