Dissertação
Bioprospecção de metabólitos secundários da própolis marrom com potencial antibacteriano e antibiofilme frente ao microrganismo Streptococcus mutans
Bioprospection of secondary metabolites from brown propolis with antibacterial and antibiofilm potential against the micro-organism Streptococcus mutans
Registro en:
ANDRADE, Rosana Moura. Bioprospecção de metabólitos secundários da própolis marrom com potencial antibacteriano e antibiofilme frente ao microrganismo Streptococcus mutans. 2022. 67 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, 2022.
Autor
Andrade, Rosana Moura
Institución
Resumen
Propolis is a natural product produced by bees to prevent the decomposition and development
of pathogenic microorganisms in the hive. Humans use propolis to treat diseases such as
microbial infections, especially of the upper respiratory tract. Among the microorganisms that
cause these infections is Streptococcus mutans. The biofilm produced by this microorganism is
an important virulence factor, as it protects it from the action of drugs and antiseptics. In this
sense, natural antibacterial products that inhibit biofilm formation can be used as an alternative
to treat infectious diseases. It was proposed, in this work, to carry out bioprospecting of
secondary metabolites of brown propolis with antibacterial and antibiofilm potential against S.
mutans. The crude extract (EB) of brown propolis was obtained by maceration and ultrasound.
Then, the EB was fractionated by liquid-liquid partition (PLL) using hexane (Hex),
dichloromethane (DCM) and ethyl acetate (AcOEt). Total phenolic compounds (CFT) and total
flavonoids (TF) were quantified spectrophotometrically. The determination of antimicrobial
activity was performed in 96-well plates using the microdilution method and biofilm formation
was evidenced by crystal violet staining. The fraction with the greatest inhibition of growth and
biofilm formation of S. mutans was submitted to classical liquid chromatography (LCC) and,
later, the most active subfractions were analyzed by High-Performance Liquid Chromatography
with photodiode array detector (HPLC- DAD). The identification of substances was performed
by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Obtaining the EB presented a yield of 47.72% (±
0.41). The ethyl acetate fraction (FAE) presented the highest concentration of CFT (87.7 ± 4.93
mg/g), while the dichloromethane fraction presented the highest concentration of TF (55.3 ±
7.52 mg/g). The crude extract exhibited a minimum inhibitory concentration (MIC) of 512
µg/mL against S. mutans. DF was the most active against S. mutans, with MIC of 256 µg/mL
and minimum bactericidal concentration (MBC) of 512 µg/mL, while FH had a MIC of 512
µg/mL. For inhibition of biofilm formation, FH exhibited activity at concentrations of 64, 32
and 16 µg/mL. FD, on the other hand, showed inhibition at concentrations of 32 and 16 µg/mL.
In this way, the FD was subjected to the fractionation of substances by CLC giving rise to 9
subfractions. Of these fractions, SBFG and SBFH were the most active against S. mutans (MIC
and CBM=128 µg/mL). After HPLC-DAD analysis, it was observed that SBFG and SBFH
presented similar chemical profiles and that the UV-Vis spectra indicated the presence of
flavonoids. The analysis by 1H NMR evidenced the presence of flavonoids of the flavone type.
With bioprospecting, it was possible to obtain two fractions rich in flavonoids with antibacterial
activity against S. mutans. Other chemical analyzes still need to be performed to elucidate the
chemical structure of these flavonoids. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A própolis é um produto natural produzido pelas abelhas para evitar a decomposição e o
desenvolvimento de microrganismos patogênicos na colmeia. Os seres humanos utilizam a
própolis para tratar doenças, como as infecções microbianas, sobretudo do trato respiratório
superior. Entre os microrganismos causadores dessas infecções encontra-se o Streptococcus
mutans. O biofilme produzido por este microrganismo é um importante fator de virulência, pois
o protege da ação de fármacos e antissépticos, bem como é fundamental para adesão à superfície
dental. Nesse sentido, produtos naturais antibacterianos que inibam a formação de biofilme
podem ser utilizados como alternativa para tratar doenças causadas por microrganismos
formadores de biofilmes. Foi proposto, neste trabalho, realizar uma bioprospecção de
metabólitos secundários da própolis marrom com potencial antibacteriano e antibiofilme frente
ao microrganismo S. mutans. O extrato bruto (EB) da própolis marrom foi obtido por maceração
e ultrassom, seguido por partição líquido-líquido (PLL), com os solventes hexano (Hex),
diclorometano (DCM) e acetato de etila (AcOEt). Os compostos fenólicos totais (CFT) e
flavonoides totais (FT) foram quantificados espectrofotometricamente. A determinação da
atividade antimicrobiana foi realizada em placas de 96 poços utilizando o método da
microdiluição e a formação de biofilme foi evidenciada a partir da coloração com cristal violeta.
A fração com melhor atividade antimicrobiana e antibiofilme foi submetida à cromatografia
líquida clássica (CLC) e, posteriormente, as subfrações mais ativas analisadas por
cromatografia líquida de alta eficiência, com detector por arranjo de fotodiodos (CLAE-DAD).
A identificação das substâncias foi realizada por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). A
obtenção do EB apresentou rendimento de 47,72% (± 0,41). A fração acetato de etila (FAE)
apresentou a maior concentração de CFT (87,7 ± 4,93 mg/g), enquanto a fração diclorometano
apresentou a maior concentração de FT (55,3 ± 7,52 mg/g). O extrato bruto exibiu concentração
inibitória mínima (CIM) de 512 µg/mL frente a S. mutans. A FD foi a mais ativa frente a S.
mutans, com CIM de 256 µg/mL e concentração bactericida mínima (CBM) de 512 µg/mL,
enquanto a FH apresentou CIM de 512 µg/mL. Para inibição da formação do biofilme, a FH
exibiu atividade nas concentrações de 64, 32 e 16 µg/mL. Já a FD apresentou inibição nas
concentrações 32 e 16 µg/mL. Deste modo, a FD foi submetida ao fracionamento das
substâncias por CLC, dando origem a 9 subfrações. Destas frações, SBFG e SBFH foram as
mais ativas contra S. mutans (CIM e CBM=128 µg/mL). Após análise por CLAE-DAD
observou-se que SBFG e SBFH apresentaram perfil químico semelhante e que os espectros de
UV-Vis sugeriram a presença de flavonoides. A análise por RMN 1H evidenciou a presença de
flavonoides do tipo flavona. Com a bioprospecção, foi possível obter duas frações ricas em
flavonoides com atividade antibacteriana frente a S. mutans. Outras análises químicas ainda
devem ser realizadas com o intuito de elucidar a estrutura química destes flavonoides. São Cristóvão