Tese
Inibição da replicação do vírus da dengue em células de mamíferos
Registro en:
Autor
Fujimura, Patrícia Tiemi
Institución
Resumen
Dengue is the most important mosquito-borne viral disease in tropical and
subtropical areas and has become a global threat affecting around 100 countries
in the world. Dengue virus infection can be manifested by the self-limited febrile
illness known as dengue fever (DF) or by a severe complication caused by the
hemorrhagic fever (DHF) or dengue shock syndrome (DSS). Although, much
research has been done in Dengue, currently, there is no licensed antiviral agent
to defend against the dengue. Thus, development of therapeutic strategies is
needed to fight against the virus. In this study we selected by Phage Display an
antibody fragment capable to recognize the viral envelop protein and viral
structural protein NS1 and inhibit the virus replication. Envelope proteins are on
the surface of the dengue virion and play a key role in cell entry; the structure of
the protein will affect the way that the virus can interact with the host cell. Given
their key role in host cell entry, antiviral mechanisms that target E proteins has
been proposed by many research. NS1 is a versatile nonstructural glycoprotein
that is expressed on the cell surface and secreted into the extracellular space. The
intracellular NS1 has been associated with early steps of viral replication, since it
can be found co-localized together dsRNA and other nonstructural protein like
NS3 and NS5. Furthermore, we development an approach to degrade the NS1
and viral envelop protein when scFv is fused to the SEL1L molecule (scFv viraldegradin).
SEL1L is a component of HRD1 complex, which is involved on the
Quality Control protein process of the endoplasmatic reticulum (ER). This
molecule (SEL1L) is able to recognize and to translocate protein with misfolded
luminal domains to proteasome. After three round of selection, selected cDNAs
encoding antibody fragments (scFv) were subcloned into an expression vector in
mammalian cells to produce scFv in soluble form or to produce scFv fused to the
SEL1L molecule (scFv viral-degradin). In our study for study of scFv against NS1,
we performed immunofluorescence to co-localize the soluble scFv with NS1 at the
infected cell. In addition to we, also, performed Western blot to verify the specific
degradation and qPCR to quantify the new production of viral particle after the
incubated with our soluble scFv and scFv viral-degradin. Our results showed that
the soluble antibody scFv co-localizes with NS1 inside the cell, probably in the viral replication complex, and it is able to block the viral replication in more than
90%. Moreover, the scFv viral-degradin degraded the specific molecule (NS1) and
it was, also, able to inhibit the new viral particle production in more than 90%.
Furthermore, we also verified that scFv against viral envelope protein was able to
block the viral replication in more than 90% in soluble scFv and fused in SEL1L.
Therefore, this soluble scFv and scFv viral-degradin may be the potential tools to
combat dengue virus replication. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Doutor em Genética e Bioquímica CAPÍTULO II: Dengue é uma doença arboviral de grande importância para a saúde pública. O
seu principal vetor de transmissão é o mosquito!Aedes aegypti, que se
desenvolve em áreas tropicais e subtropicais. Apesar de não parecer agressiva, a
dengue pode originar o aparecimento de hemorragia, evoluindo para um quadro
de febre hemorrágica ou síndrome do choque hemorrágica. Os principais
sintomas da doença hemorrágica é o aparecimento de sangramentos e queda de
pressão arterial que pode levar à morte quando mal tratada. Devido à sua
gravidade, a melhor maneira de se evitar a infecção é tomando atitudes
preventivas e impedindo a reprodução do mosquito. A fim de se combater a disseminação da doença, muitas vacinas têm sido desenvolvidas nas últimas
décadas baseada em vírus inativados, vírus atenuados quiméricos, proteínas
recombinantes e vacinas de DNA, contudo, ainda não há uma terapia antiviral
eficiente para combater o vírus da dengue. Assim, neste trabalho, selecionaramse
fragmentos de anticorpos por Phage Display capazes de reconhecerem a
proteína do envelope viral e NS1 do vírus da dengue. A região codificante o
anticorpo advindo do pComb3X foi subclonado em um vetor de expressão em
células de mamífero. Os clones celulares transfectados mostram-se capazes de
diminuir em mais de 90% o título de replicação do vírus da dengue sorotipo 1
após 1 e 3 dias de infecção., e pelo menos 78% do título do vírus no sorotipo 2
após um dia de infecção. CAPÍTULO III: A dengue é uma doença arboviral endêmica em vários países tropicais.
Embora muitos esforços têm sido feitos para a produção de vacinas
imunogênicas mais eficientes para os quatro sorotipos virais, alta taxa de erro
durante a replicação do genoma de RNA viral possibilita uma maior resistência a
terapias virais. Devido a falta de terapias e vacinas eficazes este estudo
desenvolveu um mecanismo de degradação específica contra proteínas do vírus
da dengue. Os resultados mostraram que o sistema diminuiu significativamente
a produção da proteína E do envelope viral e a molécula de NS1, inibindo, assim,
aproximadamente 90% da replicação viral após 24 e 72 horas de infecção com
o vírus da dengue tipo 1. Além disso, o mecanismo também mostrou-se eficiente
para o combate do vírus da dengue tipo 2. Este sistema pode ser uma
alternativa para a terapia da dengue ou na construção de vetores incapazes de
transmitir o vírus.