Tese
Análise de frações antigênicas da forma metacestódea de Taenia solium, obtidas pelo Triton X-114 e por cromatografia de afinidade, no diagnóstico sorológico da neurocisticercose humana
Registro en:
MACHADO, Gleyce Alves. Análise de frações antigênicas da forma metacestódea de Taenia solium, obtidas pelo Triton X-114 e por cromatografia de afinidade, no diagnóstico sorológico da neurocisticercose humana . 2008. 111 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2008.
Autor
Machado, Gleyce Alves
Institución
Resumen
Neurocysticercosis (NC) caused by Taenia solium metacestodes usually affects the
central nervous system and can be confused with other brain pathologies. The
serological diagnosis of NC is of great importance in routine clinical management of
patients because it supports the diagnosis in patients that have clinical and radiological
findings compatible with this disease. The use of purified antigens has allowed the
development of more sensitive and specific tests, resulting in reliable
seroepidemiological and screening studies. Purification procedures using Triton X-114
(TX-114) and affinity chromatography are simple and low cost methods. The aim of this
study was to characterize and to compare different antigenic fractions from crude saline
extract of T. solium metacestodes obtained by phase partitioning using TX-114 and
affinity chromatography for the serodiagnosis of human NC. A total of 132 serum
samples were analyzed, from which 40 were of patients with NC, 62 were of patients
with other parasitic diseases and 30 were from apparently healthy individuals. The
crude saline extract (S) and the cyst vesicular fluid (VF) were submitted to phase
partitioning using TX-114, resulting in following fractions: detergent (DS and DVF,
respectively) and aqueous (AS and AVF, respectively) phases. The extract S was
purified in jacalin or N-acetyl-glucosamine columns, but only the jacalin-unbound
fraction was then submitted to Concanavalin A column or TX-114 partitioning. All
antigens were analyzed in SDS-PAGE 12% and antigen bands were visualized by silver
staining. Serum samples were evaluated for IgG detection at 1:200 dilution for ELISA
and 1:100 dilution for immunoblotting. Sensitivity, specificity, diagnostic efficiency
and Youden Index were calculated for ELISA. ELISA sensitivity and specificity were
92.5% and 84.8% (extract S); 92.5% and 92.4% (DS); 67.5% and 70.6% (AS); 82.5%
and 85.9% (VF); 77.5% and 72.8 (DVF); 80.0 and 80.4% (AVF); 85.0% and 84.8%
(jacalin-unbound fraction); 92.5% and 93.5% (Detergent jacalin-unbound fraction);
82.5% and 82.6 % (Aqueous jacalin-unbound fraction), respectively. ELISA diagnostic
efficiency and Youden Index were: 87.1% and 0.77 (extract S); 92.4% and 0.85 (DS);
69.7% and 0.38 (AS); 84.8% and 0.68 (VF); 74.2% and 0.50 (DVF); 80.3% and 0.60
(AVF); 84.8% and 0.70 (jacalin-unbound fraction); 93.2% and 0.86 (Detergent jacalinunbound
fraction); 82.6% and 0.65 (Aqueous jacalin-unbound fraction), respectively.
By immunoblotting, all serum samples from NC patients recognized a 70-50 kDa band
in the detergent jacalin-unbound fraction whereas no reactivity for this antigenic
fraction was observed in serum samples from patients with other parasitoses or healthy
individuals. In conclusion, the detergent jacalin-unbound fraction showed to be more
sensitive and specific than other extracts, since it was able to discriminate NC patients
from other parasitoses, particularly Echinococcus granulosus-infected patients. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas A neurocisticercose (NC) causada pela forma metacestódea de Taenia solium
freqüentemente acomete o sistema nervoso central podendo ser confundida com outras
síndromes neurológicas. O diagnóstico sorológico da NC é de grande importância na
rotina laboratorial porque auxilia no diagnóstico de pacientes que apresentam sinais
clínicos e radiológicos compatíveis com esta doença. A utilização de antígenos
purificados tem permitido o desenvolvimento de testes mais sensíveis e específicos,
resultando em estudos soroepidemiológicos e de triagem mais confiáveis. Processos de
purificação antigênica utilizando Triton X-114 (TX-114) e cromatografia de afinidade
consistem em técnicas simples e de baixo custo. O objetivo deste estudo foi caracterizar
e comparar diferentes frações antigênicas da forma metacestódea de T. solium obtidos
por separação de fases usando TX-114 e cromatografia de afinidade para o
sorodiagnóstico da NC humana. Foram analisadas 132 amostras de soro, sendo 40 de
pacientes com NC, 62 de pacientes com outras parasitoses e 30 de indivíduos
aparentemente saudáveis. O extrato salino total (S) e o líquido de vesícula (LV) foram
submetidos ao processo de fracionamento utilizando TX-114 para a obtenção das
frações antigênicas: detergente (DS e DLV, respectivamente) e aquosa (AS e ALV,
respectivamente). O extrato S foi purificado em colunas de jacalina e N-acetilglicosamina,
sendo apenas a fração não ligante de jacalina (FNL-J) submetida à coluna
de concanavalina A (ConA) e fracionamento com TX-114. Todos antígenos foram
analisados em SDS-PAGE 12% e corados pela prata para visualização das bandas
antigênicas. As amostras de soro foram avaliadas para detecção de IgG pelo teste
ELISA na diluição de 1:200 e pelo immunoblotting na diluição de 1:100. Sensibilidade,
especificidade, eficiência do diagnóstico e Índice de Youden foram calculados para o
teste ELISA. As sensibilidades e especificidades dos testes ELISA foram: 92,5% e
84,8% (S); 92,5% e 92,4% (DS); 67,5% e 70,6% (AS); 82,5% e 85,9% (LV); 77,5% e
72,8% (DLV); 80,0% e 80,4% (ALV); 85,0% e 84,8% (FNL-J); 92,5% e 93,5%
(DFNL-J); 82,5% e 82,6% (AFNL-J), respectivamente. A eficiência do diagnóstico e o
Índice de Youden dos testes ELISA foram: 87,1% e 0,77 (S); 92,4% e 0,85 (DS); 69,7%
e 0,38 (AS); 84,8% e 0,68 (LV); 74,2% e 0,50 (DLV); 80,3% e 0,60 (ALV); 84,8% e
0,70 (FNL-J); 93,2% e 0,86 (DFNL-J); 82,6% e 0,65% (AFNL-J), respectivamente. No
immunoblotting a banda de 70-50 kDa foi detectada em todas as amostras de soro de
pacientes com NC para a fração DFNL-J, enquanto nenhuma reatividade foi observada
para esta fração antigênica nas amostras de pacientes com outras parasitoses ou
indivíduos saudáveis. Concluindo, a fração DFNL-J foi mais sensível e específica que
os outros extratos, sendo capaz de diferenciar pacientes com NC daqueles com outras
parasitoses, particularmente nas infecções por Echinococcus granulosus.