In this study, size exclusion chromatography (SEC) coupled with an online ultraviolet detection (UV) and graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF AAS) and matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) were used to study the association of selenium with macromolecules and compounds present in buffalo and cow's milk whey. SEC-UV profiles obtained from buffalo and cow's milk whey samples indicate the presence of high molecular weight (HMW) and low molecular weight (LMW) species in both samples studied. The combined information obtained with SEC-UV, GF AAS and MALDI-TOF-MS for fractions < 10 kDa confirmed the association of selenium with LMW species.Neste estudo, a cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) com detecção online ultravioleta (UV), espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GF AAS) e a espectrometria de massa por tempo de voo com dessorção/ionização de matriz assistida por laser (MALDI-TOF-MS) foram usadas para estudar a associação de selênio com macromoléculas e compostos presentes no soro de leite de búfala e bovino. Os perfis de SEC-UV obtidos para as amostras de soro de leite de búfala e soro de leite bovino indicaram a presença de espécies de alta e baixa massa molecular. A combinação das informações obtidas com SEC-UV, GF AAS e MALDI-TOF-MS para as frações < 10 kDa confirmou a associação de selênio com espécies de baixa massa molecular.