Os ácidos biliares totais (TBA) e os ácidos graxos não esterificados (NEFA) são metabólitos produtos do metabolismo do colesterol e triglicerídeos respectivamente. A alta concentração de TBA acomete o fígado e vesícula biliar, incitando doenças como colestases, hepatites, cirroses e esclerose do fígado. Já a alta concentração de NEFA possui correlação direta com o estado nutricional do organismo e é alterado em doenças como obesidade e diabetes tipo II. De modo geral, a quantificação desses analitos são de extrema importância para auxílio diagnóstico de diversas doenças hepatobiliares e metabólicas que acometem a saúde humana e animal. Devido a necessidade de diagnóstico precoce, rápido, fácil e prático, o objetivo desse trabalho buscou desenvolver duas formulações para kits de diagnóstico in vitro para quantificação de TBA e NEFA por bioquímica líquida. Além disso, do ponto de vista empresarial objetivou-se reduzir custos e nacionalizar tecnologia. A formulação desenvolvida para NEFA promove a quantificação do analito por meio de uma cascata de reações enzimáticas, o qual o seu produto pode ser dosado por colorimetria de forma específica frente aos principais interferentes endógenos. Enquanto a dosagem pela formulação de TBA ocorreu por leitura espectrofotométrica da formação de ThioNAD em ciclos de oxidação e redução enzimática. Para o desenvolvimento de ambas as formulações foram realizadas pesquisas bibliográficas e ensaios de otimização para melhoramento de performance para atingir os parâmetros determinados e exigidos no mercado de diagnóstico in vitro para cada analito. Sendo assim, houve mudanças na composição e concentrações para atingir melhor exatidão, robustez frente aos interferentes endógenos comuns, determinação de intervalo operacional e estabilidade. A formulação de TBA foi finalizada com sucesso enquanto a formulação de NEFA ainda necessita de modificações para melhorar o desempenho de estabilidade. Contudo, ambas demonstraram bom desempenho, de forma se tornar potencialmente competitiva, compatível ao mercado e útil no auxílio diagnóstico in vitro de relevância clínica animal e humana. Palavras-chave: Ácidos graxos não esterificados. NEFA. Ácidos biliares totais (TBA). Doenças metabólicas. Doenças hepatobiliares. Diagnóstico in vitro.Total bile acids (TBA) and non-esterified fatty acids (NEFA) are metabolites of cholesterol and triglyceride metabolism, respectively. The high concentration of TBA affects the liver and gallbladder, inciting diseases such as cholestasis, hepatitis, cirrhosis and liver sclerosis. The high concentration of NEFA has a direct correlation with the nutritional status of the body and is altered in diseases such as obesity and type II diabetes. In general, the quantification of these analytes is extremely important to aid in the diagnosis of several hepatobiliary and metabolic diseases that affect human and animal health. Due to the need for early, fast, easy and practical diagnosis, the objective of this work sought to develop two formulations for in vitro diagnostic kits for quantification of TBA and NEFA by liquid biochemistry. Furthermore, from the business point of view, the objective was also to reduce costs and nationalize technology. The formulation developed for NEFA promotes the quantification of the analyte through a cascade of enzymatic reactions, in which its product can be dosed by colorimetry in a specific way against the main endogenous interferents. While the dosage by the TBA formulation occurs by spectrophotometric reading of the formation of ThioNAD in cycles of enzymatic oxidation and reduction. For the development of both formulations, bibliographic research and optimization tests were carried out to improve performance to achieve the parameters determined and required in the in vitro diagnostic market for each analyte, so there were changes in the composition and concentrations to achieve better accuracy, robustness against common endogenous interferents, determination of operational range and stability. The TBA formulation was successfully completed while the NEFA still needs modifications to improve stability performance. However, both showed good performance, in order to become potentially competitive, compatible to the market and useful in aiding in vitro diagnostics of animal and human clinical relevance.Keywords: Non-esterified fatty acids. NEFA. Total bile acids. TBA. Metabolic diseases. Hepatobiliary diseases. In vitro diagnosis.