Os cascudos são peixes pertencentes à família Loricariidae que apresentam distribuição em toda região Neotropical. Hypostomus ancistroides (Loricariidae: Hypostominae) é considerado um complexo de espécies crípticas, visto que diversos morfotipos já foram encontrados em diferentes bacias em toda sua área de distribuição, em especial na bacia do Alto rio Paraná. Este complexo de espécies possui representantes com variações relacionadas à morfologia e principalmente, à macroestrutura cariotípica. São observados polimorfismos quanto ao número diploide, fórmulas cariotípicas, localização de genes ribossomais e presença de sistemas cromossômicos sexuais. Uma população do rio Paranapanema, Hypostomus aff. ancistroides, apresenta características peculiares: número cromossômico reduzido, pequenas diferenças morfológicas, monofiletismo quando comparada às outras populações e ainda, a existência de um sistema cromossômico sexual simples único para o grupo, o que sugere tratar-se de um novo táxon. O objetivo deste trabalho foi investigar, sob uma abordagem evolutiva e utilizando ferramentas da genômica, as características que distinguem duas espécies do complexo de espécies crípticas “Hypostomus ancistroides” (Hypostomus aff. ancistroides e Hypostomys ancistroides). Os objetivos específicos foram identificar e comparar os genomas mitocondriais completos, os padrões de metilação de DNA e os satelitomas duas espécies, assim como validar e identificar fisicamente os DNAs satélites encontrados. Os genomas mitocondriais apresentaram organização semelhante aos dados disponíveis para peixes e vertebrados, entretanto, a região D-loop em H. ancistroides é composta por 321 pb a mais que H. aff. ancistroides. Além disso, a topologia da árvore filogenética utilizando os 13 genes codificadores de proteínas mostra localização em ramos diferentes das duas espécies, refletindo a diferenciação entre elas. Foram observadas diferenças no número de sequências repetitivas entre os satelitomas, sendo muitas destas exclusivas de cada espécie. Na hibridação com satDNAs, alguns hibridaram nas duas espécies e outros apresentaram-se como espécie- específicos. Não foram encontrados sítios em nenhum dos cromossomos sexuais, provavelmente por serem compostos em grande parte por eucromatina. Quanto ao padrão de metilação do DNA, H. ancistroides apresentou relação entre regiões compostas por heterocromatina e metiladas. Já indivíduos de H. aff. ancistroides, demonstraram marcações positivas por quase todos os cromossomos do complemento, com o macho apresentando padrão mais hipermetilado. Os cromossomos X e Y foram identificados como praticamente metilados, sugerindo inativação de genes. Com base em todos os dados apresentados, reforça-se que H. aff ancistroides é uma nova espécie do complexo, pois apresenta diferenças morfológicas, citogenéticas, moleculares, mitocondriais e genômicas em relação à H. ancistroides, sendo necessário ser formalmente descrita e nomeada como uma espécie taxonomicamente válida. Palavras-chave: Cascudo. DNA repetitivo. Evolução. Metilação. Mitogenoma. Satelitoma.Armoured catfishes are fish belonging to the Loricariidae family that are distributed throughout the Neotropical region. Hypostomus ancistroides (Loricariidae: Hypostominae) is considered a complex of cryptic species, since several morphotypes have already been found in different basins throughout their range, especially in the Upper Paraná River basin. This species complex has representatives with variations related to morphology and mainly, to the karyotype macrostructure. Polymorphisms are observed in terms of diploid number, karyotype formulas, location of ribosomal genes and presence of sex chromosome systems. A population of the Paranapanema river, Hypostomus aff. ancistroides, has peculiar characteristics: reduced chromosome number, small morphological differences, monophyletism when compared to other populations, and the existence of a simple sexual chromosome system unique to the group, which suggests that it is a new taxon. The aim of this work was to investigate, under an evolutionary approach and using genomic tools, the characteristics that distinguish two species from the cryptic species complex “Hypostomus ancistroides” (Hypostomus aff. ancistroides and Hypostomys ancistroides). The specific objectives were to identify and compare the complete mitochondrial genomes, the DNA methylation patterns and the two species satellites, as well as to validate and physically identify the satellite DNAs found. The mitochondrial genomes showed an organization similar to the available data for fish and vertebrates, however, the D-loop region in H. ancistroides is made up of 321 bp more than H. aff. ancistroides. In addition, the topology of the phylogenetic tree using the 13 protein-coding genes shows location in different branches of the two species, reflecting the differentiation between them. Differences in the number of repetitive sequences were observed between satellitomas, many of which are unique to each species. In the hybridization with satDNAs, some hybridized in the two species and others presented themselves as species-specific. No sites were found on any of the sex chromosomes, probably because they are largely composed of euchromatin. As for the DNA methylation pattern, H. ancistroides showed a relationship between heterochromatin and methylation regions. H. aff. ancistroides, showed positive markings on almost all complement chromosomes, with the male showing a more hypermethylated pattern. The X and Y chromosomes were identified as practically methylated, suggesting inactivation of genes. Based on all the data presented, it is reinforced that H. aff ancistroides is a new species of the complex, as it presents morphological, cytogenetic, molecular, mitochondrial and genomic differences in relation to H. ancistroides, being necessary to be formally described and named as a taxonomically valid species. Keywords: Armoured catfish. Evolution. Methylation. Mitogenome. Repetitive DNA. Satelitome.