Pimelodidae possui 114 espécies que são amplamente distribuídas ao longo da região Neotropical. Pimelodus é o gênero com o maior número de espécies e filogeneticamente um grupo polifilético. Dentre as espécies do gênero, Pimelodus microstoma Steindachner, 1877 (Siluriformes: Pimelodidae) é uma espécie típica da bacia do rio Alto Paraná do estado de São Paulo, que morfologicamente apresenta um padrão de cor cinza uniforme com apenas alguns pontos escuros (às vezes muito fracos ou ausentes), presença de uma nadadeira adiposa longa, boca pequena e um barbilhão maxilar pequeno. Citogeneticamente, essa espécie se caracteriza por apresentar conservadorismo no número diploide (2n), no padrão de distribuição da heterocromatina e na localização dos sítios Ag-RONs. Nesse contexto, este estudo descreve a primeira ocorrência de P. microstoma na bacia do rio Paraíba do Sul nos rios Pomba e Novo, no estado de Minas Gerais, Brasil, afim de melhor contribuir para o entendimento de processos evolutivos, de problemas taxonômicos, biogeográficos e filogenéticos. Foram aplicadas técnicas convencionais de analises cromossômicas (Giemsa, banda C e AgRONs), padrões de marcação das sondas de DNA repetitivo (GA (15) e CA (15) ) além de análises filogenéticas moleculares utilizando o gene citocromo oxidase subunidade I (COI). Os indivíduos de P. microstoma apresentaram o mesmo o padrão morfológico, citogenético e molecular dos indivíduos de P. microstoma do rio Mogi-Guaçu, pertencente à bacia do Alto Paraná, estado de São Paulo. Foi observado um conservadorismo no número diploide de 2n=56 cromossomos, uma pequena quantidade de heterocromatina distribuída na região dos telômeros de alguns cromossomos. Além de sítios de marcações das AgRONs presentes no braço maior do par de cromossomos submetacêntrico 17. Os microssatélites CA( 15) e GA( 15) apresentaram um padrão de distribuição preferencial nas regiões terminais da maioria dos cromossomos. A filogenia obtida com o gene COI indicou a falta de estruturação na rede de haplótipos com baixa distância molecular entre as espécies de P. microstoma nas bacias do rio Paraíba do Sul e do Alto Paraná. Sendo assim, estes dados corroboram que os representantes de P. microstoma de ambas as bacias compreendem ser uma única espécie. Portanto, P. microstoma é uma espécie introduzida no rio Paraíba do Sul por evento de cabeceira, sendo sua identificação confirmada por análises morfológicas, citogenéticas e moleculares, representando assim o primeiro registro da espécie fora da bacia do Alto Paraná. Palavras-chave: Dissertação. Bacia do rio Paraíba do Sul. Biogeografia. Citogenética Clássica e Molecular. Filogenia Molecular.Pimelodidae has 114 species that are widely distributed throughout the Neotropics. Pimelodus is the genus with the largest number of species, and, phylogenetically, it is a polyphyletic group. Pimelodus microstoma Steindachner, 1877 (Siluriformes: Pimelodidae) is a typical species from the Alto Paraná basin in the state of São Paulo, Minas Gerais,Brazil, which morphologically presents a uniform gray color pattern with only a few dark spots (sometimes very light or absent), presence of a long adipose fin, small mouth and jaw. Cytogenetically, this species is characterized by conservatism in the diploid number (2n), heterochromatin distribution pattern and location of Ag-RONs sites. In this context, this study describes the occurrence of P. microstoma in the Paraíba do Sul river basin in the Pomba and Novo rivers, in the state of Minas Gerais, Brazil, in order to better contribute to the understanding of evolutionary processes, and taxonomic, biogeographical and phylogenetic issues. Conventional chromosomal analysis techniques (Giemsa, C band and AgRONs), repetitive DNA probes GA (15) and CA (15) marking patterns, and molecular phylogenetic analyzes using the subunit I cytochrome oxidase gene (COI) were applied. The individuals of P. microstoma presented the same morphological, cytogenetic and molecular patterns as individuals of P. microstoma from the Mogi- Guaçu river, which belong to the Alto Paraná basin, state of São Paulo. A conservatism was observed in the diploid number of 2n = 56 chromosomes, with small amount of heterochromatin distributed in the region of the telomeres of some chromosomes, besides the AgRON marking sites be present in the larger arm of the submetacentric chromosome pair 17. Microsatellites(CA (15) and GA (15) showed a distribution pattern preferentially in the terminal regions of most chromosomes. The phylogeny obtained with the COI gene indicated the lack of structure in the haplotype network, with low molecular distance between P. microstoma species in the Paraíba do Sul and Alto Paraná basins. Therefore, these data corroborate that the representatives of P. microstoma from both basins are a single species. Therefore, P. microstoma is a species introduced in the Paraíba do Sul river by headwater piracy event, being its identification confirmed by morphological, cytogenetic and molecular analyzes, and thus representing the first record of the species outside the Alto Paraná basin. Keywords: Dissertation. Biogeography. Classical and Molecular Cytogenetics. Molecular Phylogeny. Paraíba do Sul River Basin.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais