O objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologia de conservação de sêmen de Prochilodus vimboides e Prochilodus lineatus, da bacia do rio Paraíba do Sul, a curto e a longo prazo. Os experimentos foram realizados na estação de piscicultura do Projeto Piabanha/PESAGRO–RJ e no Campo Experimental EPAMIG de Leopoldina, durante as piracemas de 2013/2014 e 2014/2015. Exemplares de Grumatã Prochilodus vimboides e Curimba Prochilodus lineatus foram induzidos com extrato bruto de hipófise de Carpa. Posteriormente, o sêmen foi coletado e suas características seminais avaliadas. No experimento de resfriamento o sêmen foi diluído na proporção 1:9 (v/v, sêmen: diluidor) em soluções compostas por NaCl 0,9%, NaCl 1,2%, glicose 5%, BTS 5% ou MIII 6%. Uma alíquota do sêmen foi mantida sem diluição (controle). A motilidade espermática foi ativada como solução de NaCl 0,29% e subjetivamente avaliada após 0, 1, 2, 3, 4 e 5 dias de armazenamento a 4-6oC. Na criopreservação do sêmen, foram utilizados os mesmos diluidores testados no resfriamento, porém combinados com três crioprotetores (dimetilsulfóxido-DMSO, Metilglicol e Etilglicol), na proporção 1:8:1 (sêmen:diluidor:crioprotetor). As amostras seminais diluídas foram envasadas em palhetas de 0,5 mL, congeladas em botijão de vapor de nitrogênio líquido e posteriormente armazenadas em nitrogênio líquido. Após o descongelamento em banho- maria a 60°C por 8 segundos, a motilidade espermática foi subjetivamente estimada em percentagem. Além disso, avaliou-se o estresse oxidativo ocorrido nessas amostras. A concentração espermática observada para P. vimboides foi de 27,1±15,8 x 10 9 espermatozoides/mL e o volume seminal de 1,4±0,7 mL. Para P. lineatus foi observado concentração espermática de 20,4 ± 6,4 x 10 9 espermatozoides/mL e volume seminal de 2,0 ± 0,4 mL. No resfriamento, amostras diluídas em BTS preservaram a motilidade espermática acima de 30% por até 2 dias em temperaturas de 4-6oC para P. vimboides e até 5 dias para P. lineatus, sendo este diluidor o melhor entre os testados (P<0,05). No congelamento, amostras seminais diluídas nas criosoluções compostas por glicose 5%+Metilglicol, apresentaram as maiores motilidades espermáticas (60% ± 11,8%; P<0,05) para P. vimboides, pós-descongelamento. Também foi observado nessas amostras menores atividades de catalase e peroxidação lipídica (MDA; P<0,05) nas células espermáticas. Já em P. lineatus as amostras seminais diluídas nas criosoluções compostas por glicose 5%+DMSO (dimetilsufóxido) foram as que proporcionaram as maiores motilidades espermáticas (66,1%±4,0%; P<0,05) e menores atividades de SOD, catalase (CAT) e peroxidação lipídica (MDA; P<0,05). Portanto, o sêmen de P. vimboides pode ser resfriado por até 48 horas em solução diluidora de BTS 5% e criopreservado em criosolução composta por glicose 5% + Metilglicol. E o sêmen de P. lineatus pode ser resfriado por até 5 dias em solução de BTS 5% e criopreservado em criosolução composta por glicose 5% + DMSO, com sucesso.The objective in this work was to develop a methodology of semen conservation of Prochilodus vimboides and Prochilodus lineatus, from Paraíba do Sul river basin, at short and long period. The experiments were realized in the station of fish culture of the project Piabanha/PESAGRO–RJ and in the experimental field EPAMIG from Leopoldina during the “piracemas” from 2013/2014 and 2014/2015. Specimes of Grumatã Prochilodus vimboides and Curimba Prochilodus lineatus were induced by pituitary extract from carp. After the semen was collected and their seminal characteristics were evaluated. In the cooling experiment, the semen was diluted in the proportion 1:9 (v/v, semen, diluting) in saline solutions of NaCl 0,9%, NaCl 1,2%, glucose 5%, BTS 5% or M III 6%. One semen aliquot was kept undiluted and was used as control. The sperm motility was activated with solution of NaCl 0,29% and subjectively evaluated after 0, 1, 2, 3, 4 and 5 days of storage at 4-6oC. In the semen cryopreservation, were used the same extenders tested in the cooling, however combined with three cryoprotectants (dimethyl sulphoxide – DMSO, methylglycol and ethylglycol), in the proportion of 1:8:1 (semen, extender, cryoprotectant). The seminal samples diluted were potted in containers of 0,5 mL, frozen in nitrogen liquid vapor container and then stored in liquid nitrogen. Sperm motility was subjectively evaluated after thawing at 60°C-water bath for 8 s. Beside this, was evaluated the oxidative stress in these samples. The spermatic concentration observed for P. vimboides was of 27,1±15,8 x 10 9 sperm/mL and the seminal volume of 1,4±0,7 mL. For P. lineatus was observed spermatic concentration of 20,4 ± 6,4 x 10 9 sperm/mL and the seminal volume of 2,0 ± 0,4 mL. In cooling, samples diluted in BTS maintained the spermatic motility above 30 % for as long as 2 days at 4-6oC for P. vimboides and as long as 5 days for P. lineatus, being this extender the better between those tested (P<0,05). In freezing, seminal samples diluted in the cryosolutions composed by glucose 5%+ Methylglycol, presented higher spermatic motility (60% ± 11,8%; P<0,05) for P. vimboides post-thaw. Was also observed in these samples low activity of catalase and lipid peroxidatiom (MDA; P<0,05) in the spermatic cells. In P. lineatus the seminal samples diluted in cryosolutions composed by glucose 5%+DMSO (dimethyl sulphoxide) were those that provided the higher spermatic motility (66,1%±4,0%; P<0,05) and lower activity of SOD, catalase (CAT) and lipid peroxidation (MDA; P<0,05). However, the semen of P. vimboides can be cooled for up to 48 hours in extender solution of BTS 5% and cryopreserved in cryosolution composed by glucose 5% + Methylglycol. The semen of P. lineatus can be cooled for up to 5 days in solution of BTS 5% and cryopreserved in cryosolution composed by glucose 5% +DMSO, with success.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais