Os tripanossomatídeos são protozoários patogênicos em humanos, animais e plantas e cujas espécies mais conhecidas pertencem aos gêneros Leishmania e Trypanosoma. Estes parasitas apresentam uma complexa regulação da expressão gênica controlada por eventos pós-transcricionais, muitos dos quais afetando o metabolismo dos seus mRNAs. A proteína de ligação à cauda poli-A (PABP) é uma das principais proteínas de ligação à mRNAs em eucariotos e possui um papel crítico na tradução e em outros processos. Três homólogos de PABPs foram descritos em Leishmania, sendo que a PABP1 foi confirmada como estando ativa na tradução, enquanto que as PABPs 2 e 3 interagem entre si e parecem estar associadas a mRNAs distintos aos da PABP1, mas as funções específicas de cada homólogo ainda não são bem definidas. Este trabalho teve como objetivo investigar diferenças funcionais entre estes três homólogos em Leishmania infantum, definindo se são ou não essenciais para a sobrevivência celular e identificando motivos críticos para sua função. Primeiro, foram construídos cassetes para deleção dos genes das PABPs 2 e 3 seguido de sua transfecção no patógeno. Pudemos observar a essencialidade da PABP2 e a não essencialidade da PABP3, sendo que a PABP1 foi confirmada como essencial em estudos prévios. Mutantes das PABPs 1 e 2 foram então gerados por mutagênese sítio-dirigida, expressos em L. infantum e testados quanto a sua capacidade de complementar a função da proteína nativa após a deleção dupla dos genes endógenos. Podemos concluir que os motivos LMW e YGF são críticos para a função da PABP1, enquanto que dois outros motivos não equivalentes, RQN e TGM, parecem ser essenciais para a PABP2. Mutantes também foram gerados para a PABP3, bem como um mRNA repórter que se espera capaz de se associar especificamente às PABPs 2 e 3. Estes resultados demonstram que os três homólogos atuam de maneira diferenciada e geram ferramentas para novos estudos, mais avançados, sobre a função dessas proteínas.CNPq.Trypanosomatids are pathogenic protozoan for humans, animals and plants, whose best known species belong to the Leishmania and Trypanosoma genera. These parasites have a complex regulation of their gene expression which is controlled by post-transcriptional events, many of which affect the metabolism of their mRNAs. The poly-A binding protein (PABP) is one of the major mRNA binding proteins in eukaryotes and plays a critical role during translation and other processes. Three PABP homologues have been described in Leishmania, with PABP1 confirmed as being active in translation, whereas PABPs 2 and 3 interact with each other and appear to be associated with mRNAs other than PABP1. The specific functions of each homologue are still not well defined. This work aimed to investigate functional differences between these three homologues in Leishmania infantum, defining whether or not they are essential for cell survival and identifying critical motifs for their function. First, constructs were designed to delete both copies of the PABP 2 and 3 genes in the pathogen. We could observe the essentiality of PABP2 and the non-essentiality of PABP3, with PABP1 being confirmed as essential in previous studies. Mutants of PABP 1 and 2 were then generated by site-directed mutagenesis, expressed in L. infantum and tested for their ability to complement the native protein’s function after double deletion of the endogenous genes. We concluded that the LMW and YGF motifs are critical for the PABP1 function, while two other non-equivalent motifs, RQN and TGM, appear to be essential for PABP2. Mutants have also been generated for PABP3 as well as a mRNA reporter that is expected to be able to specifically associate with PABPs 2 and 3. These results demonstrate that the three homologues act in a differentiated manner and generate tools for further, more advanced studies on the function of these proteins.2020-02-01