Leishmania spp. expressando fluorescência vermelha (tdTomato) como modelo para triagem de substâncias anti-Leishmania

dc.contributorMurta, Silvane Maria Fonseca
dc.contributorAlves, Maria de Almeida
dc.contributorOliveira, Edward José de
dc.contributorMurta, Silvane Maria Fonseca
dc.contributorAlves, Tânia Maria de Almeida
dc.contributorSteindel, Mario
dc.contributorRoyo, Vanessa de Andrade
dc.creatorCruz, Mariza Gabriela Faleiro de Moura Lodi
dc.date2022-10-20T16:26:27Z
dc.date2022-10-20T16:26:27Z
dc.date2022
dc.date.accessioned2023-09-26T22:28:29Z
dc.date.available2023-09-26T22:28:29Z
dc.identifierCRUZ, Mariza Gabriela Faleiro de Moura Lodi. Leishmania spp. expressando fluorescência vermelha (tdTomato) como modelo para triagem de substâncias anti-Leishmania. Belo Horizonte: s.n, 2022. 122 p. Dissertação-Ministério da Saúde. Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
dc.identifierhttps://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/55210
dc.identifier.urihttps://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8879702
dc.descriptionAs leishmanioses são doenças infecciosas causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidas pela picada de fêmeas de insetos flebotomíneos infectados. As leishmanioses são classificadas como doenças negligenciadas, apresentando grande importância para saúde pública mundial. No Brasil, as espécies de Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum representam grande relevância epidemiológica e causam a leishmaniose tegumentar e visceral, respectivamente. Apesar de atualmente existirem medicamentos disponíveis para o tratamento das leishmanioses, estes apresentam limitações, como alta toxicidade, necessidade de administração parenteral, e ocorrência de parasitos resistentes aos fármacos disponíveis. A descoberta de novos fármacos para o tratamento da leishmaniose é, portanto, fundamental. No entanto, a metodologia clássica para avaliar a susceptibilidade das formas amastigotas às substâncias (contagem as amastigotas intracelulares) não pode ser reproduzida em alta escala, sendo necessário desenvolver uma nova metodologia, que deve ser fácil, rápida, efetiva e de baixo custo. O uso de genes repórteres para seleção de fármacos/substâncias já é utilizado em muitos estudos. O tdTomato consiste em uma variação da proteína fluorescente vermelha clonada do coral Discosoma. Ela é a proteína fluorescente mais brilhante disponível, e pode substituir o uso da luciferase nos ensaios in vivo e in vitro, tornando os ensaios mais rápidos e mais baratos. Nesse contexto, o objetivo desse estudo foi validar o uso de L. (V.) braziliensis e L. (L.) infatum, expressando constitutivamente o gene repórter tdTomato como modelo para triagem em larga escala de substâncias anti-Leishmania. Assim, L. braziliensis e L. infatum foram transfectadas com o plasmídeo pIR1BSD_tdTomato linearizado e a fluorescência vermelha dos clones foi confirmada por microscopia confocal e citometria de fluxo. A microscopia de Lb e Li::tdTomato mostrou que a fluorescência vermelha está distribuída por todo parasito, inclusive no flagelo; e a citometria demonstrou que o brilho dos parasitos é intenso. As formas promastigotas e amastigotas intracelulares dos clones expressando tdTomato de forma constitutiva, foram avaliadas in vitro quanto ao seu perfil de crescimento em cultura e à sua susceptibilidade aos fármacos anfotericina B, antimônio trivalente e miltefosina. O comportamento das linhagens mutantes em relação à curva de crescimento, perfil de infectividade, susceptibilidade aos fármacos foram similares comparados aos parasitos selvagens não transfectados, indicando que a expressão constitutiva do tdTomato não interfere nesses parâmetros avaliados. Além disso, foi possível avaliar a susceptibilidade desses parasitos a fármacos já comercialmente disponíveis, pensando na estratégia de reposicionamento, e a triagem de extratos naturais e substâncias puras possibilitando a descoberta de novas substâncias ativas. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os parasitos mutantes expressores de tdTomato obtidos podem ser utilizados como modelo em ensaios de avaliação de susceptibilidade de substâncias anti-Leishmania in vitro. A padronização dessa nova metodologia tem como potencial permitir maior rapidez, menor custo e facilidade na triagem de substâncias in vitro contra L. braziliensis e L. infantum. Além disso, essa metodologia pode potencializar a descoberta de substâncias/fármacos ativos para o tratamento das leishmanioses.
dc.descriptionCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq 304158/2019-4) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG – APQ-02816-21) Programa INOVA FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz (VPPCB-007-FIO-18-2-94)
dc.descriptionLeishmaniasis are infectious diseases caused by protozoan of the genus Leishmania, transmitted by the bite of infected female sandflies insects. The leishmaniasis are classified as neglected diseases, presenting great importance for global public health. In Brazil, the Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) infantum especies represent great epidemiological relevance, and causes the tegumentary and visceral leishmaniasis, respectively. Although currently medicines for the treatment are available, they present limitations, such as high toxicity, parenteral administration and the ocorrence of resistant parasites. The discovery of new drugs for leishmaniasis treatment is therefore fundamental. The classical methodology to evaluate the susceptibility of amastigote forms to compounds (cellular amastigote counting) can not be reproduced in high scale, being necessary development of a new methodology that must be easy, fast, effective, and cheaper. The use of reporter genes for the selection of compounds is already used in many studies. The tdTomato consists of a red fluorescent protein variant cloned from the Discosoma. It is the brightest fluorescent protein available, and it can replace the use of the luciferase in vivo and in vitro assays, making the assay faster and cheaper. In this context, the aim of this study was to validate the use of L. braziliensis e L. infantum, constitutively expressing the tdTomato reporter gene as a model for large-scale screening of anti-Leishmania compounds. Thus, L. braziliensis e L. infantum were transfected with the linearized plasmid p1R1BSD_tdTomato, and the red fluorescence of clones was confirmed by confocal microscopy and flow cytometry. The microscopy of Lb and Li::tdTomato showed that the red fluorescence is distributed throughout the parasite, including the flagellum; and the cytometry demonstrated that the brightness of the parasites is intense. The promastigote and amastigote forms of the clones constitutively expressing tdTomato were evaluated in vitro for their growth profile, and their susceptibility to the compounds amphotericin B, trivalent antimony and miltefosine. The behavior of the mutant lines in relation to the growth curve, profile of infectivity and susceptibility to the compounds were similar compared to wild non-transfected parasites, indicating that the constitutive expression of tdTomato does not interfere in these parameters evaluated. In addition, it was possible to assess the susceptibility of these parasites to drugs already commercially available, thinking in the repositioning strategy, and the screening of natural extracts and pure substances enabling the discovery of new active compounds. The results obtained in this work indicate that the tdTomato-expressing mutant parasites obtained can be used as a model in assays to evaluate the susceptibility of anti-Leishmania compounds in vitro. The standardization of this new methodology has the potential to allow faster, lower cost and ease in the in vitro screening of compounds against L. braziliensis and L. infantum. In addition, this methodology can enhance the discovery of active compounds for the treatment of leishmaniasis.
dc.formatapplication/pdf
dc.languagepor
dc.publishers.n.
dc.rightsrestricted access
dc.subjectLeishmania
dc.subjecttdTomato
dc.subjecttriagem in vitro de substâncias
dc.subjectquimioterapia
dc.subjectLeishmania
dc.subjecttdTomato
dc.subjectin vitro screening of compounds
dc.subjectchemotherapy
dc.subjectLeishmaniose
dc.subjectQuimioterapia
dc.subjectFluorescência
dc.titleLeishmania spp. expressando fluorescência vermelha (tdTomato) como modelo para triagem de substâncias anti-Leishmania
dc.typeDissertation


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