O vírus atenuado da febre amarela, subcepa 17DD, é utilizado por Bio-Manguinhos para a produção da vacina contra a febre amarela. Esta vacina tem sido empregada há anos para a imunização humana com um excelente histórico de eficácia e segurança. Para a quantificação dos títulos de anticorpos neutralizantes produzidos como resposta imunológica a vacinação é utilizada o método ouro PRNT - Teste de neutralização por redução de placas de lise (Plaque Reduction Neutralization Test). Entretanto, este método possui algumas particularidades que precisam ser consideradas, tais como alto custo analítico devido ao tempo requerido para a emissão de um resultado, pessoal eficientemente treinado, necessidade de equipamentos e insumos específicos não sendo, portanto, facilmente passível de uso em rotina severa ou sua utilização em grande escala. Por isso, justifica-se a necessidade de desenvolvimento de um método alternativo para a quantificação desses anticorpos. Para a implementação deste novo método alternativo torna-se necessário o desenvolvimento de um método que permita quantificar anticorpos antivírus febre amarela em amostras de soros. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um ensaio imunoenzimático para quantificação de anticorpos contra o vírus da Febre Amarela presente no soro de um grupo de indivíduos brasileiros imunizados com a vacina 17DD produzida em Bio-Manguinhos. Para este propósito, foram obtidas partículas virais da subcepa 17DD, a partir de culturas de células Vero, o anticorpo monoclonal 2D12 específico para a proteína E do envelope do vírus da FA e o soro padrão preparado in house utilizado como controle positivo (M7/100) foi obtido de macacos Rhesus (Macaca mulata). Foram utilizados diferentes soros amostrais, os quais foram titulados pelos métodos de PRNT e ViBI, onde foi possível realizar a comparação dos métodos, para avaliar a equivalência dos resultados, assim como foram realizados o estudo da validação, com os testes de seletividade, curva de calibração, precisão, exatidão, limite de quantificação e limite de detecção. Ficou demonstrado que a comparação entre os métodos ViBI e PRNT foi equivalentemente aceitável, já que quando comparados soros amostrais dos mesmos indivíduos, os resultados tiveram uma correlação alta de acordo com a avaliação realizada pelas análises estatísticas Spearman, Mann Whitney e Wilcoxon. No estudo da validação, demonstrou-se que o método ViBI pode ser utilizado para titular anticorpos que inibem a ligação do vírus da febre amarela em indivíduos sabidamente vacinados com a vacina de Febre Amarela.The yellow fever attenuated virus, sub 17DD strain is used by Bio-Manguinhos for the production of a vaccine against yellow fever. This vaccine has been used for years for human immunization with an excellent traceability of efficacy and safety. For quantification of neutralizing antibodies produced as immunological response to immunization method is used "gold" PRNT - Plaque Reduction Neutralization Test). However, this method has some peculiarities that need to be considered, such as high cost analytical due to the time, efficiently trained staff need specific equipment and supplies not being therefore easily capable of use in severe routine or its use on a large scale. Therefore, it justifies the need to develop an alternative method for the quantification of these antibodies. To implement this new alternative method, it is necessary to develop a method for quantifying antibodies anti yellow fever virus in the serum samples. This study aimed at the development and validation of an immunoassay for the measurement of antibodies against the virus of yellow fever present in the serum of a group of Brazilian individuals immunized with the Brazilian 17DD substrains vaccine produced by Bio-Manguinhos. For this purpose, Brazilian YF17DD substrains were obtained from Vero cells cultures, monoclonal antibody specific 2D12 to the envelope E protein of FA virus and standard serum prepared in house used as positive control (M7 / 100) was obtained from rhesus monkeys (Macaca mulatta). Different sample sera were used, which were titrated by methods PRNT and ViBI where it was possible to compare methods, to assess the equivalence of results as were performed to study the validation, the selectivity tests, curve calibration, precision, accuracy, limit of quantification and detection limit. It demonstrated that the comparison between the methods ViBI and PRNT was equivalently acceptable, as compared sampling serum from the same individuals, the results had a high correlation according to the assessment made by the statistical analyses of Spearman, Mann Whitney and Wilcoxon. In the validation study demonstrated that the ViBI method can be used for titration of antibodies in individuals vaccinated with the known yellow fever vaccine.