Introdução: A sepse neonatal é atualmente uma significante causa de óbito e de morbidade nas unidades neonatais e ocupa um papel importante nas causas de óbito. Objetivos: avaliar os métodos diagnósticos usados na detecção da sepse neonatal na Unidade de Tratamento Intensivo Neonatal do Instituto Fernandes Figueira. Material e métodos: Realizamos um estudo retrospectivo, através de revisão de prontuários e da revisão de exames laboratoriais realizados em recém-nascidos internados no período de janeiro de 2000 a dezembro de 2002. Foram avaliados todos os exames realizados nos recém-nascidos para investigação de sepse neonatal. Os dados foram analisados através de qui-quadrado, anova ou testes não paramétricos e apresentados em forma de tabelas. Resultado: Foram avaliados 205 prontuários de pacientes internados. A incidência de sepse precoce foi baixa estando presente em 4 casos correspondendo a 2 por cento da população estudada. A sepse tardia confirmada(hemocultura positiva), obteve uma freqüência de 45 casos em 205 correspondendo a 22 por cento da população. Do total de 205 pacientes 83,9 por cento (172 RNs) foram rastreados para infecção na admissão e 169 pacientes foram rastreados para infecção após 72 horas de vida.Dos 169 com suspeita de sepse, 45 obtiveram hemocultura positiva caracterizando o quadro de sepse tardia comprovada. Durante o período de estudo, foram realizados 1904 exames de laboratório incluíndo hemocultura, proteína C-reativa e leucograma. O exame mais solicitado foi o leucograma em um total de 860 exames.Os principais microorganismos responsáveis pela sepse tardia foram: Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase-negativa, Gram negativos, Cândida sp Conclusões: A incidência de sepse tardia confirmada na população de prematuros de muito baixo peso ao nascer estudada é alta e os exames laboratoriais foram realizados em grande número, apresentando um baixo índice de positividade.