A Classe Kinetoplastea abrange a ordem Trypanosomatida que apresenta uma única família: Trypanosomatidae. Os representantes dessa família possuem como apomorfia o cinetoplasto, DNA mitocondrial único e altamente compactado, e um único flagelo. A classificação taxonômica desses tripanossomatídeos fundamentada unicamente em caracteres morfológicos e nos seus ciclos de vida não reflete a diversidade genética e as relações evolutivas do grupo. Atualmente, as abordagens moleculares são rotineiramente empregadas para estudos filogenéticos e taxonômicos. Neste trabalho, realizamos uma revisão das relações filogenéticas entre os gêneros da subfamília Leishmaniinae para espécies selecionadas do gênero Leishmania, Paraleishmania e Endotrypanum (nomem dubium), além de analisar novos isolados oriundos de projetos de prospecção de biodiversidade da Coleção de Protozoários da Fiocruz (COLPROT) visando avaliar a ocorrência de tripanossomatídeos na ordem Lepidoptera. Para isto, foram sequenciados e analisados dois genes gGAPDH e 18S que possuem uma base de dados ampla disponível no Genbank e são difundidos como ferramenta taxonômica de tripanossomatídeos, embora sejam pouco explorados para resolver questões taxonômicas do gênero Leishmania. As análises corroboram com a proposição de criação de duas infrafamílias na subfamília Leishmaniinae. Na infrafamília Leishmaniatae, a análise concatenada das sequências dos genes demonstrou que esses genes não possuem boa resolução para identificar espécies do gênero Leishmania, mas permite a classificação em complexos e subgêneros Também foi definida a sinonímia de uma cepa de Leishmania forattinii em Herpetomonas samuelpessoai. As análises também mostram que os gêneros Paraleishmania, Endotrypanum (nomen dubium) e Leishmania são filogeneticamente próximos entre si. Na infrafamília Crithidiatae, as análises mostram proximidades filogenéticas entre espécies de Crithidia e Leptomonas. Além disso, foi realizada a identificação taxonômica de 33 isolados de tripanosomatídeos obtidos de insetos da ordem Lepidoptera, sendo possível constatar três espécies já descritas na literatura: C. mellificae, C. thermophila e C. insperata; isolados representantes de seis OTUs possíveis candidatas a: i) novas espécies do gênero Crithidia (Crithidia sp1; Crithidia sp2; Crithidia sp3; Crithidia sp4); ii) uma nova espécie do gênero Strigomonas (Strigomonas sp.) e iii) um possível novo gênero (Trypanosomatidae sp.). Os resultados aqui apresentados indicam a necessidade da integração dos dados obtidos por análises moleculares com critérios bioquímicos, morfológicos e de interação parasito-hospedeiro para compreender melhor a filogenia e evolução da subfamília Leishmaniinae, assim como o aprofundamento da biodiversidade do grupo.The Kinetoplastea class comprises the order Trypanosomatida, which has a single family: Trypanosomatidae. The representatives of this family have a single flagellum and the apomorphy is the kinetoplast, a compacted DNA from the single mitochondrium. The taxonomic classification of these trypanosomatids based solely on morphological characters and their life cycles do not reflect the genetic diversity and evolutionary relationships of the group. Nowadays, molecular approaches are routinely employed for taxonomic and phylogenetic studies of trypanosomatids. Here, we reviewed the phylogenetic relationships among genus of subfamily Leishmaniinae, focusing on selected species of the genera Leishmania, Paraleishmania and Endotrypanum (nomen dubium), we also analyzed new isolates from biodiversity prospecting projects at Fiocruz Protozoa Collection (COLPROT) to evaluate the occurrence of trypanosomatids in the Lepidoptera. To this end, two genes were sequenced and analyzed, gGAPDH and 18S, which have a large database (Genbank) and are widely used as a trypanosomal taxonomic tool, although they are little explored for Leishmania genus. Our results corroborate the proposition for creating two infamilies in the Leishmaniinae subfamily. In the Leishmaniatae infrafamily, concatenated analysis of the gene sequences has shown that these genes do not have a good resolution to identify species of the genus Leishmania, but it allows the classification into complexes and subgenus. Our results also indicate the synonymization of a Leishmania forattinii strain to Herpetomonas samuelpessoai The phylogenetic analysis also shows that the genus Paraleishmania, Endotrypanum (nomen dubium) and Leishmania are phylogenetically related to each other. In Crithidiatae infrafamily, the analyzes showed the phylogenetic proximity between Crithidia and Leptomonas species. In addition, we performed the taxonomic identification of 33 isolates of the Lepidoptera order. Among the 33 isolates, we identified three species that were already described in the literature: C. mellificae, C. thermophila and C. insperata; isolates representatives of six possible OTUs, which are candidates for: i) new species of the genus Crithidia (Crithidia sp1; Crithidia sp2; Crithidia sp3; Crithidia sp4); ii) a new species of the genus Strigomonas (Strigomonas sp.) and iii) a candidate for a total new genus (Trypanosomatidae sp.). The results presented herein indicate the necessity to integrate the data obtained by molecular analysis with the biochemical, morphological and parasite-host interaction criteria to better understand the phylogeny and evolution of the Leishmaniinae subfamily, as well as to deepen the biodiversity knowledge of this group.