O ciprofloxacino é o antimicrobiano mais usado entre os pertencentes à classe das quinolonas. É pouco metabolizado pelo organismo, o que permite o desenvolvimento de técnicas analíticas para o estudo da molécula íntegra a partir de matrizes biológicas. Neste trabalho, foi validado um método bioanalítico para a determinação de ciprofloxacino em urina humana, utilizando a cromatografia líquida de ultra eficiência com detecção por ultravioleta. O método compreendeu uma técnica pré-analítica de diluição com acetonitrila e água ultra pura, apresentando simplicidade e baixo custo. A separação cromatográfica foi realizada através da coluna Shim-pack XR-ODS III 2.2 μm (200 x 2.0 mm), com fase móvel constituída por metanol, fase A, e metanol 10% mais 0,5% de ácido fórmico, fase B, com eluição por gradiente e tempo de corrida de 10,5 min. O tempo de retenção foi de 5,1 min. A faixa de concentração estudada ficou entre 10 e 540 μg e as curvas de calibração obtidas foram lineares, com fatores de correlação maiores que 0,98. Os ensaios para validação seguiram o estabelecido pela Resolução 27 de 2012 da ANVISA, e foram avaliados os seguintes parâmetros: seletividade, efeito residual, efeito matriz, curva de calibração, precisão, exatidão e estudo de estabilidade. Os resultados obtidos nas análises para validação atenderam à norma e permitiram assegurar a confiabilidade do método, que poderá ser aplicado em estudos farmacocinéticos realizados no Hospital Naval Marcílio Dias da Marinha do Brasil.