A doença de Chagas (DC) é considerada um agravo ainda negligenciado. Atualmente, estima-se cerca de 10 milhões de pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi, em todo o mundo, principalmente na América Latina. Sabe-se que alguns derivados de naftoquinonas podem agir sobre a tripanotiona redutase (TR), enzima específica dos tripanossomatídeos responsável pelo controle oxidativo celular. A inibição da TR favorece um processo oxidativo e morte do protozoário. Este trabalho teve como objetivo investigar o potencial anti-T.cruzi da fitomenadiona, (K1) e menadiona (K3), ambas vitaminas K derivadas de naftoquinonas. Com este propósito, o efeito tripanocida de K1 e K3 foi avaliado através de ensaios in vitro com as formas tripomastigotas e epimastigotas do T. cruzi nas cepas Colombiana e Y utilizando os testes de inibição, citotoxicidade dos compostos, ensaio de infecção em macrófagos, avaliação de alterações ultraestruturais, bem como ensaio em in vivo para avaliação na redução da parasitemia. Os valores de IC50 mais significativos para formas tripomastigotas do T. cruzi foram 27,55 μM para K1, 2,19 μM para K3 e 12,46 μM para o benzonidazol, a droga padrão. Contudo, o tratamento com a vitamina K1 não reduziu a parasitemia in vivo, que permaneceu alta assim como a do controle tratado com veículo. A vitamina K3 foi capaz de inibir ambas as cepas e diferentes formas do parasito em ensaios in vitro. No ensaio de infecção de macrófagos, a vitamina K3 em concentração de 21,4 μM inibiu de forma mais significativa a infecção de células em relação à droga padrão, em concentração de 38,4 μM. Apesar da citotoxicidade mais elevada, esta droga apresentou uma seletividade maior ao parasito do que a células de mamíferos e, em baixas doses, causou a redução na parasitemia in vivo. As avaliações ultraestruturais por microscopia eletrônica de transmissão evidenciaram alterações celulares induzidas por estes compostos, destacando-se a tumefação do cinetoplasto e a presença de vacúolos. A quantificação ultraestrutural na avaliação por microscopia eletrônica de varredura demonstrou alterações em cerca de 80% dos parasitos observados quando tratados com K3 a 5 μM. Nossos resultados demonstram o efeito anti-T. cruzi das moléculas testadas e sugerem que estas possam servir de base para o desenho de novos compostos candidatos a fármacos para o tratamento da doença de Chagas.Chagas disease (AD) is considered a neglected disease. Currently, it is estimated 10 million people infected with Trypanosoma cruzi, worldwide, mostly in Latin America. It is known that some derivatives of naphthoquinones can act on the trypanothione reductase (TR), specific enzyme of trypanosomatids responsible for controlling oxidative stress. Inhibition of TR favors an oxidative process and death of the parasite. This work aimed to investigate the potential anti-T. cruzi of phytomenadione, (K1) and menadione (K3), both vitamin K derived from naphthoquinones. For this purpose, the trypanocidal effect of K1 and K3 was evaluated by in vitro assays with epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi in strains Colombian and Y using the inhibition tests, cytotoxicity of compounds of infection in macrophages test, evaluation of ultrastructural alterations as well as in vivo test to evaluate the reduction of the parasitemia. The best IC50 values to trypomastigote forms of T. cruzi were 27.55 μM to K1 and 2.19 μM to K3, compared to 12.46 μM of benznidazole, the standard drug. However, the treatment with vitamin K1 did not reduce parasitemia in vivo, which remains high similar to the vehicletreated control group. Vitamin K3 was able to inhibit both strains and different forms of the parasite in in vitro assays. In macrophage infection assay, vitamin K3 at a concentration of 21.4 μM significantly inhibited T. cruzi infection of cells when compared to the standard drug (benznidazole) in a concentration of 38.4 μM. Although this compound had a high cytotoxicity, vitamin K3 showed greater selectivity than the parasite mammalian cells, and in a low dose caused a reduction in parasitemia in vivo. The ultrastructural evaluation by transmission electron microscopy revealed cellular alterations induced by these compounds, especially the swelling of the kinetoplast and the presence of vacuoles. The ultrastructural quantification in the evaluation by scanning electron microscopy showed changes in about 80% of parasites observed when treated with 5 μM K3. Our results demonstrate the anti-T. cruzi molecules tested, suggesting that they may serve as a basis for designing new drug candidate compounds for the treatment of Chagas disease.