| dc.contributor | Wowk, Pryscilla Fanini | |
| dc.creator | Cerato, Júlia Amanda | |
| dc.date | 2022-12-01T13:44:25Z | |
| dc.date | 2022-12-01T13:44:25Z | |
| dc.date | 2021 | |
| dc.date.accessioned | 2023-09-26T20:39:34Z | |
| dc.date.available | 2023-09-26T20:39:34Z | |
| dc.identifier | CERATO, Júlia Amanda. Desenvolvimento e caracterização de ferramentas para estudos do papel da osteopontina durante a infecção pelo vírus da dengue. 2021. 91f. Dissertação, (mestrado)-Instituto Carlos Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Curitiba, 2021. | |
| dc.identifier | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/55845 | |
| dc.identifier.uri | https://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/8861488 | |
| dc.description | A dengue é a arbovirose que se alastra mais rapidamente pelo mundo constituindo um sério problema de saúde pública global. É uma doença com um amplo espectro de manifestações clínicas, responsável por aproximadamente 100-400 milhões de infecções por ano no mundo. O Brasil contribui com o maior número de casos notificados de dengue. Não há tratamento específico para dengue, sendo assim necessária a busca de potenciais alvos para terapias antivirais como proteínas celulares que possuem a expressão passível de modulação e que são relevantes durante a infecção com o Dengue virus (DENV). A osteopontina (OPN) é uma glicoproteína, envolvida em diversos sinais transcricionais e vias de sinalização. Também foi sugerido seu envolvimento na polarização da resposta imune celular. Em processos inflamatórios, tais como infecções virais, a expressão da OPN se encontra aumentada. Para avaliar o papel da OPN e a dinâmica da sua expressão durante a infecção in vitro com o DENV o presente projeto focou no desenvolvimento e caracterização de ferramentas para estudo desta proteína. Quatro anticorpos monoclonais (AcMs) anti-OPN foram caracterizados quanto ao seu perfil de reatividade em linhagens celulares através da técnica de imunofluorescência indireta e pela técnica de Western Blot quanto a sua reatividade à proteína recombinante. Os AcMs apresentam perfis de reação distintos nas linhagens testadas e apenas um dos AcMs apresentou reatividade no Western Blot. Para gerar uma linhagem de células A549 deficientes em OPN duas estratégias distintas foram empregadas, a partir do uso do sistema constituído por repetições palindrômicas curtas interespaçadas e regularmente agrupadas (CRISPR) e sua proteína associada 9 (Cas9). A primeira estratégia foi baseada na eletroporação do complexo ribonucleoprotéico e a segunda baseada na eletroporação do plasmídeo a partir do qual é transcrito o RNA guia e o RNA mensageiro para síntese de SpCas9 na célula alvo. Embora as duas estratégias tenham mostrado indícios de edição gênica, o desenvolvimento de uma linhagem clonal deficiente na expressão de osteopontina ainda não foi possível. Resultados preliminares do grupo e a literatura indicavam que a OPN é modulada durante a infecção com DENV. Desse modo, células A549 foram infectadas com DENV-4 e a expressão de OPN foi avaliada em diferentes tempos pós-infecção. No entanto, não foi observada alteração na expressão da OPN nas células A549 infectadas ou não com DENV. Por fim, o trabalho que foi realizado contribuiu na assimilação de conhecimento técnico sobre as técnicas de edição gênica empregadas, contribuiu para uma melhor caracterização dos AcMs previamente gerados no laboratório e nos permitiu avançar na compreensão do papel que a proteína desempenha durante a infecção por DENV. | |
| dc.description | Dengue is an arbovirus that rapidly spreads across the world constituting a serious global public health issue. It is a disease with a large spectrum of clinical manifestations, responsible for approximately 100-400 million infections per year in the world. Brazil contributes with the highest number of dengue notified cases. There isn’t a specific treatment for dengue, so it is necessary to seek for potential targets of antiviral therapies such as cellular proteins that are susceptible to expression modulation and are relevant during infection with Dengue virus (DENV). Osteopontin (OPN) is a glycoprotein, involved in several transcriptional signs and signaling pathways. It has also been suggested to be involved in the polarization of the cellular immune response. In inflammation processes, as viral infections, OPN is upregulated. To assess the role of OPN and its expression dynamics during the in vitro infection with DENV, this project has focused on the development and characterization of tools to study the protein in question. Four anti-OPN monoclonal antibodies (mAbs) were characterized regarding their reactivity profile in cell lines through the indirect immunofluorescence technique and through Western Blot regarding their reactivity to the recombinant protein. The mAbs demonstrated different reaction profiles in the cell lines tested and only one mAb showed reactivity in Western Blot. To generate an OPN-deficient A549 cell line two different strategies were employed, making use of the system constituted of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and its associated protein 9 (Cas9). The first strategy was based on the electroporation of the ribonucleoprotein complex and the second on the electroporation of a plasmid from which a guide RNA and messenger RNA are transcribed for the synthesis of SpCas9 in the target cell. Although, both strategies have shown evidence of gene edition, the development of a clonal cell line deficient for osteopontin expression was still not possible. Preliminary results from the group and from the literature indicated that OPN is modulated during DENV infection. Thus, A549 cells were infected with DENV-4 and OPN expression was evaluated in different times post-infection. However, no change in OPN expression was observed in A549 cells with or without DENV infection. Finally, the work that was carried has contributed in the assimilation of technical knowledge about the gene editing techniques that were employed, contributed to a better characterization of the mAbs previously generated in the laboratory and allowed us to advance in the comprehension of the role the protein plays during DENV infection. | |
| dc.format | application/pdf | |
| dc.language | por | |
| dc.rights | open access | |
| dc.subject | Vírus da Dengue | |
| dc.subject | Dengue Virus | |
| dc.subject | Modulação | |
| dc.subject | Modulation | |
| dc.subject | Osteopontin | |
| dc.subject | Osteopontina | |
| dc.title | Desenvolvimento e caracterização de ferramentas para estudos do papel da osteopontina durante a infecção pelo vírus da dengue | |
| dc.type | Dissertation | |
