Dissertation
Análise proteômica da forma tripomastigota de uma população de Trypanosoma cruzi susceptível e outra resistente ao benzonidazol.
Registro en:
SANTOS, Sara Lopes dos. Análise proteômica da forma tripomastigota de uma população de Trypanosoma cruzi susceptível e outra resistente ao benzonidazol. 2008. 90 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)-Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)-Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2008
Autor
Santos, Sara Lopes dos
Resumen
A Doença de Chagas é um grande problema de saúde pú
blica na América
Latina. Atualmente nos países das Américas Central
e do Sul há de 16 a 20 milhões
de pessoas infectadas pelo
Trypanosoma cruzi
e 40 milhões sob risco da infecção.
O tratamento da Doença de Chagas com os nitroderiva
dos, benzonidazol e
nifurtimox, apresenta consideráveis efeitos colater
ais, além de baixa eficácia na fase
crônica da doença e variações na eficácia em pacien
tes de diferentes origens
geográficas. Este fato pode ser explicado pela resi
stência natural do
T. cruzi
aos
nitroderivados. A resistência a drogas tem um grand
e impacto na quimioterapia da
Doença de Chagas, aumentando a falha terapêutica e
limitando as opções de
tratamento. Através de estudos dos mecanismos de re
sistência do
T. cruzi
a drogas,
novos alvos bioquímicos poderão ser identificados.
O objetivo deste trabalho é
identificar proteínas nas formas tripomastigotas do
T. cruzi
que possam estar
envolvidas no mecanismo de resistência ao benzonida
zol. Devido às diferenças
entre as formas morfoevolutivas do parasito, é impo
rtante que o mecanismo de
resistência seja estudado nas diferentes fases do s
eu ciclo de vida. Além disso, a
análise proteômica é particularmente importante por
que a regulação da expressão
gênica nestes organismos ocorre por mecanismos de c
ontrole pós-transcricionais.
As formas tripomastigotas foram obtidas através de
infecção
in vitro
de células Vero
com duas populações de
T. cruzi
: BZR, selecionada
in vivo
com resistência ao
benzonidazol, e seu par susceptível,BZS (Murta & Ro
manha, 1998). Para garantir a
qualidade das amostras de tripomastigotas, a contam
inação da cultura de células e
parasitos por
Mycoplasma
foi monitorada através da PCR gênero-específica e
da
observação de células ao microscópio óptico de fluo
rescência. A diferença de
susceptibilidade determinada
in vitro
ao Bz entre as populações BZR e BZS de
T.
cruzi
foi de aproximadamente 8 vezes quando avaliamos a
atividade direta da droga
sobre as formas tripomastigotas, e de 2 a 3 vezes s
obre a liberação dos parasitos de
células infectadas. Formas tripomastigotas das duas
populações foram produzidas,
purificadas e concentradas em quantidade suficiente
para a análise por eletroforese
bidimensional. Proteína total das duas populações f
oi analisada por eletroforese
bidimensional e as imagens dos 6 géis bidimensionai
s de 17cm (triplicatas de cada
população) foram analisadas pelo
software
PDQuest. As proteínas diferencialmente
expressas entre as duas populações foram indicadas
a partir de análise quantitativa
da intensidade dos
spots
detectados e pareados entre os géis bidimensionais
de cada população. 244 spots foram analisados e 23
spots
apresentaram intensidade
diferencial entre as populações, sendo: 3 expressos
somente na população BZR e 5
somente na população BZS, 5 mais expressos na popul
ação BZR e 10 mais
expressos na população BZS. Estes
spots
serão localizados nos géis, excisados e
digeridos por Tripsina para identificação por espec
trometria de massa. PDTIS/Fundação Oswaldo Cruz Instituto René Rachou Fapemig Chagas’disease is a major public health problem in
Central and South
America, where 16-20 million people are infected wi
th
Trypanosoma cruzi
.
Nitroheterocyclic drugs, benznidazole (Bz) and nifu
rtimox (Nf), are currently used to
treat Chagas’ disease. Both drugs have frequent sid
e-effects, very low anti-parasitic
activity in long-term chronic forms of the disease
and variable efficacy according to
the geographical area. The existence of strains nat
urally resistant and susceptible to
Bz and Nf drugs was previously described. Efforts a
re necessary to provide a better
understanding of
T. cruzi
drug resistance mechanisms, which may result in th
e
identification of new drug targets and new chemothe
rapeutic tools. These efforts
must be directed to each stage of
T. cruzi
life cycle. Furthermore, proteomic analysis
is particularly important because the regulation of
gene expression in
T. cruzi
occurs
by post-transcriptional mechanisms. The aim of this
work is to identify trypomastigote
proteins potentially involved in the Bz resistance
mechanisms. Trypomastigote forms
from two populations selected
in vivo
, Bz resistant (BZR) and Bz susceptible (BZS)
(Murta & Romanha, 1998), were maintained in Vero ce
ll monolayers and collected. In
order to assure the quality of the trypomastigotes
samples used, specific PCR was
used to monitor the
Mycoplasma
contamination of the cell and parasite cultures. C
ell
observation on fluorescence microscope after specif
ic coloration was also used to
monitor the contamination. The resistance/susceptib
ility phenotype of the
T cruzi
populations was determined by two
in vitro
assays. The colorimetric assay showed
that trypomastigotes from population BZR are approx
imately 8-fold more resistant to
benznidazole then BZS trypomastigotes. In a second
assay, in which the
benznidazole activity on parasite released from hos
t cells was evaluated, the
difference observed ranged from 2 to 3-fold between
the BZR and BZS populations.
Comparative proteomic analysis between BZR and BZS
trypomastigote forms were
carried out by bidimensional electrophoresis and im
age analysis of 17cm
bidimensional gels (triplicates from each
T. cruzi
population) using the software
PDQuest. 244 spots were analyzed and 23 correspond
to differently expressed
proteins between the BZR and BZS populations, as in
dicated after quantitative
analysis of spot quantity between the gels of trypo
mastigotes total protein from BZR
and BZS populations. From these 23 spots, 3 are onl
y expressed in BZR population
and 5 only in BZS, 5 are more expressed in BZR popu
lation and 10 more expressed in BZR. The identification of the differentially ex
pressed proteins will be performed by
mass spectrometry and similarity searching against
the
T. cruzi
protein databases.