Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram-positiva formadora de esporas, que produce cristales parasporales de naturaleza proteica, tóxicos contra diferentes órdenes de insectos y biodegradables e inocuos para otras especies. Esta investigación empleó el modelo experimental, que mediante técnicas de observación permitió, la identificación microbiológica y bioquímica de B. thuringiensis a partir de muestras de suelo de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia, y su posterior caracterización con los marcadores moleculares Bc-Rep y MB1. Se identificaron microbiológica y bioquímicamente 10 aislados como B. thuringiensis; los resultados del análisis filogenético mostraron diferencias significativas en los agrupamientos obtenidos con los marcadores Bc-Rep y MB1. Con Bc-Rep se registró un índice de similaridad bajo (18%), mientras que con el marcador MB1 se obtuvo un índice mayor de similitud, 58%. En este trabajo se evidenció una gran variabilidad genética entre los aislados, que mostraron a los marcadores Bc-Rep y MB1 como altamente efectivos para diferenciar cepas estrechamente relacionadas, convirtiéndose en una herramienta genética de gran valor para estudios de identificación y diversidad en B. thuringiensis.