Inducción de la diferenciación de células madre mesenquimales y pre-osteoblastos cultivados con medio condicionado In vitro

Abstract

Antecedentes: Las células madre mesenquimales (MSCs) se han venido investigando en regeneración tisular, con la intención de desarrollar nuevas alternativas terapéuticas en diferentes patologías que requieran regeneración o neoformación ósea, como en labio y paladar hendido (LPH). La incidencia mundial de LPH ha aumentado en los últimos años, siendo los injertos óseos los tratamientos más comunes a pesar de sus complicaciones. La ingeniería de tejidos viene desarrollando alternativas a la colocación directa de MSC, analizando moléculas bioactivas secretadas por las células (secretoma) como inductores de diferenciación celular; sin embargo, no hay claridad sobre cuál secretoma es más efectivo. Objetivo: Comparar el efecto sobre la diferenciación de células mesenquimales de pulpa (hDPSCs) y pre-osteoblastos (Saos-2), al ser cultivados con medio condicionado (secretoma). Métodos: Previa aprobación del comité institucional de ética y firma de consentimiento informado, se cultivaron y caracterizaron hDPSC de terceros molares con extracción indicada y células Saos-2 (ATCC HTB-85™). Las hDPSCs se trataron con secretoma de Saos-2 (hDPSCs/Saos-2) y las Saos-2 con secretoma de hDPSCs (Saos-2/hDPSCs). Se evaluaron cambios fenotípicos con microscopio invertido, la tasa de proliferación celular mediante ensayo de resazurina, formación de nódulos de calcio mediante rojo de alizarina, y cambios en expresión de RUNX2 y Osteocalcina (OCN) mediante RT-qPCR. Los experimentos se realizaron por triplicado. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA, Kruskall-Wallis y Scheffé. Resultados: Saos-2/hDPSCs a partir de los 8 días de tratamiento se observaron más largadas y fibroblastoides comparadas con el control, similares a las tratadas con medio de diferenciación osteogénica (MD). hDPSCs/Saos-2 aumentaron sus prolongaciones celulares, su tamaño y su aspecto fibroblastoide; estos cambios fueron más evidentes que en las tratadas con MD. hDPSCs/Saos-2 y MD redujeron la proliferación celular a partir del día 10 de tratamiento, con relación al control (p<0.05). Saos-2/hDPSCs incrementaron la proliferación del sexto al octavo día de tratamiento, posteriormente se redujo el número de Saos-2/hDPSCs y MD, en comparación con control (p<0.05). Se evidenciaron nódulos de mineralización en todos los grupos experimentales y la mayor absorbancia del colorante se evidenció en hDPSCs/Saos-2, Saos-2/hDPSCs y MD a los 21 días de tratamiento, siendo mayor el valor encontrado en Saos-2/hDPSCs comparada con las hDPSCs/Saos-2 (p>0.05). Al evaluar genes de diferenciación celular se encontró que el gen RUNX2 incrementó su expresión significativamente en el grupo de células DPSC tratadas con MD durante 7 días. Después de 21 días se observó un incremento de la expresión de este gen en las células Saos-2/DPSC y en las tratadas con MD. La expresión de OCN también se vio aumentada en las células DPSC y Saos-2 tratadas con MD y en las células Saos-2/ DPSC durante 7 y 21 días. Conclusión: El secretoma de DPSC y de Saos-2 indujo cambios morfológicos, reducción en la proliferación y formación de nódulos de calcificación que sugieren la inducción de diferenciación hacia un fenotipo osteoblástico. Sin embargo, la expresión de marcadores de diferenciación ósea como OCN y RUNX2 solo se incrementaron en las células tratadas con MD y en las células Saos-2/DPSC.