Trabajo de grado - Maestría
Crioconservación de semen de dorada Brycon sinuensis con diferentes crioprotectores a dos porcentajes de inclusión
Autor
Carmona Calderón, Jorge Armando
Institución
Resumen
El objetivo del estudio fue evaluar la criopreservación de semen de dorada Brycon sinuensis con dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida (DMA) o etilenglicol (EG) a dos porcentajes de inclusión (5 o 10%); para lo cual se indujeron 12 machos con 5 mg extracto hipofisario de carpa por Kg de peso y seis horas después el semen fue colectado en tubos Falcón de 20 ml. El semen fue diluido (1:4) en la solución crioprotectora compuesta por glucosa 6%, yema de huevo 12% y DMSO o DMA o EG a dos porcentajes de inclusión (5 o 10%); luego fue empacado en pajillas de 2.5 mL y congelado en vapores de nitrógeno líquido (NL) durante 30 minutos y posteriormente almacenadas en NL en termos de 34 L. El semen fue descongelado por inmersión directa en baño serológico a 35°C durante 60 segundos. La calidad del semen fresco, precongelado y descongelado fue evaluada con la ayuda del software Sperm Class Analyzer (SCA, Microptic, España) y un microscopio de contraste de fase (Nikon E55, Japón) mediante la movilidad total, tipos de movilidad (rápida, media, lenta), espermatozoides inmóviles, velocidades (lineal y curvilínea), progresividad total y concentración espermática. Además, en el semen descongelado, se evaluaron los daños en membrana espermática (D-Mem), en mitocondria (D-Mit) y fragmentación de DNA (F-DNA) mediante citometría de flujo (Citómetros FACS CANTO II, BD Biosciences San José, CA y LSR 2 FORTESSA) (BD Biosciences San José, CA). El semen fresco presentó alta movilidad total (97.07.0%); mientras que en semen precongelado (82.517.9%) y descongelado (45.413.6%) fue mayor cuando fue tratado con DMSO10% (p<0.05). En semen descongelado los D-Mem oscilaron entre 62.118.8% (DMA 5%) y 49.89.8% (DMSO 5%), los D-Mit oscilaron entre 59.414.8% (DMA 5%) y 83.44.2% (DMSO 10%) y F-DNA oscilaron entre 9.5±14.0% (EG10%) y 1.6±0.2% (DMA10%) sin observarse diferencia estadística entre estos valores (p>0.05). Los resultados del presente estudio permiten concluir que DMSO incluido a 5 o 10%, registró mejor calidad del semen descongelado al compararlo con los obtenidos con DMA y EG; sin embargo, la capacidad fecundante del semen criopreservado con esta solución crioprotectora (DMSO 5 o 10%, yema de huevo 12% y glucosa 6%) debe ser evaluada mediante pruebas de fertilidad y eclosión. 1. INTRODUCCIÓN 14 2. OBJETIVOS 17 2.1. OBJETIVO GENERAL 17 2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO 17 3. HIPÓTESIS 18 3.1. HIPÓTESIS NULA (H0) 18 3.2. HIPÓTESIS ALTERNATIVA (H1) 18 4. MARCO TEÓRICO 19 4.1. BIOECOLOGÍA DE DORADA Brycon sinuensis 19 4.2. CRIOCONSERVACIÓN DE SEMEN DE PECES 20 4.2.1. Crioprotectores 23 4.3. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD ESPERMÁTICA 24 4.3.1. Movilidad espermática 25 4.3.2. Daño en membrana espermática y mitocondrias 26 4.3.3. Fragmentación del DNA 27 4.3.3. Fragmentación del DNA 27 5. METODOLOGÍA 28 5.1. LOCALIZACIÓN Y DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DEL ESTUDIO 28 5.2. MATERIAL BIOLÓGICO 28 5.3. OBTENCIÓN DEL SEMEN Y EVALUACIÓN SEMINAL 29 5.4. TRATAMIENTOS 29 5.5. CRIOPRESERVACIÓN DEL SEMEN 30 5.5.1. Empacado y congelación 30 5.5.2. Descongelación del semen 31 5.6. CALIDAD SEMINAL 31 5.6.1. Volumen seminal 31 5.6.2. Concentración espermática 31 5.6.3. Tiempo de activación 32 5.6.4. Movilidad total, tipos de movilidad, velocidades y progresividad espermática
32 5.7. EVALUACIÓN DE DAÑOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO 32 5.7.1. Daño en la membrana espermática y mitocondrias 32 5.7.2. Fragmentación del DNA 33 5.8. DISEÑO EXPERIMENTAL Y ANALISIS ESTADÍSTICO 34 6. RESULTADOS 35 6.1. CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN DE DORADA 35 6.2. CALIDAD DEL SEMEN PRECONGELADO 35 6.3. CALIDAD DEL SEMEN DESCONGELADO 37 6.4. DAÑO CELULAR EN SEMEN DESCONGELADO 39 6.4.1. Daño en mitocondrias 39 6.4.2. Daño en membrana espermática 40 6.4.3. Fragmentación del DNA 40 6.5. EFECTO DE FACTORES EVALUADOS Y SU INTERACCIÓN 41 7. DISCUSIÓN 43 8. CONCLUSIONES 53 9. BIBLIOGRAFÍA 54 Maestría Magíster en Ciencias Ambientales Trabajos de Investigación y/o Extensión