Expresión y determinación de la actividad enzimática de la tirosina descarboxilasa (TYDC) en E. coli BL21 (DE3) para la biosíntesis de p-tiramina a partir de l-tirosina

Abstract

La Tirosina Descarboxilasa (TyDC) constituye una enzima de gran relevancia en la biosíntesis de alcaloides en plantas de la familia de las Amarilidáceas, entre estos tenemos la licorina. Con ello, se lleva a cabo la expresión genética y determinación de los parámetros cinéticos de la Tirosina Descarboxilasa en E. coli BL21 (DE3) de manera in vitro, para la biosíntesis de p-tiramina. Inicialmente, se empleó el clúster genético pM20-tdcA, que, en principio, tiene el gen codificante de la enzima. Se transformó genéticamente a E. coli BL21 (DE3). Se validó la presencia del gen mediante la técnica molecular de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y Secuenciación Automatizada de Sanger. Con lo anterior, se hipotetiza que las condiciones de expresión génica de dicha enzima, podría corresponder a 0.3 mM de IPTG, 14°C a 6h. Igualmente, se estima que la concentración de enzima en los extractos bacterianos de 0.0367, 0.0343 y 0.0218 mg/mL para las fracciones correspondiente al Extracto Total de Proteínas (ETP), Lisado Clarificado (LC) y Cuerpos de Inclusión (CI) respectivamente. Así se obtiene una constante catalítica (Kcat) de 0.397 s-1 , una velocidad máxima (Vmax) de 0.00197 mMs-1 , una constante de Michaelis-Menten de 14.6 mM y una Unidad de Actividad Específico del extracto bacteriano (U/mg) de 0.00937. La gran mayoría de estos parámetros, podrían estar asociados a la enzima en la célula y no de manera pura. Lo mencionado, permite obtener resultados experimentales de carácter bioquímico y molecular de dicha enzima, para su posterior implementación en una fábrica biológica funcional.