Ensaios de duplex PCR em tempo real (TaqMan probe) para identificação de espécies de Leishmania relacionadas com a etiologia da leishmaniose tegumentar Americana

Abstract

Objetivou-se avaliar a aplicabilidade da tecnologia de sondas TaqMan para diagnóstico e identificação de Leishmania spp. relacionadas com a etiologia da LTA. Realizou-se alinhamentos múltiplos de Leishmania spp. para diferentes alvos. O melhor alvo foi selecionado para desenho de primers e sondas capazes discriminarem entre as espécies. Após padronização individual, os sistemas foram combinados para compôr a Duplex-qPCR (DqPCR). A DqPCR foi avaliada em amostras obtidos de pacientes do Amazonas e Pernambuco, e comparada ao conjunto de critérios estabelecido. A capacidade da DuplexqPCR identificar espécie foi comparada a técnica de isoenzimas e sequenciamento. De acordo com a conveniência, pacientes foram acompanhados através de coleta de sangue antes e após tratamento para correlação da carga parasitária com a evolução clínica e terapêutica. O Internal Transcribed Spacer 1 foi o alvo selecionado. Dois conjuntos de primers e sondas foram desenhados, SVS para subgênero Viannia e LaS para L. amazonensis. Um total de 236 pacientes participaram da pesquisa (127 AM; 109 PE), e foram obtidas 101, 33 e 147 amostras de sangue, biópsia e imprint, respectivamente. A amostra de imprint foi mais sensível ao teste. A DqPCR e o conjunto de critérios concordaram em 123 (83,67%) amostras de imprint, apresentando 83,06% de sensibilidade, 86,96% de especificidade e concordância moderada. Quanto a identificação da espécie, a DqPCR e o sequenciamento/isoenzimas concordaram em 100%. Foi realizado o acompanhamento de 23 indivíduos (13 AM; 10 PE). Nas amostras de sangue obtidas pré-tratamento, 17 foram positivas, enquanto na coleta póstratamento 11. Nos pacientes acompanhados, foi notável falha na eliminação dos parasitos mesmo clinicamente curados, além de não observar cura clínica em pacientes infectados por L. guyanensis. Assim, nota-se a relevância do diagnóstico e identificação da espécie em um único momento a fim de melhorar a qualidade de vida dos pacientes acometidos pela LTA.