Dissertation
Desenvolvimento e caracterização de linhagem celular expressando estavelmente um replicon repórter do vírus Zika
Fecha
2019Registro en:
SILVA, Caroline Simões. Desenvolvimento e Caracterização de Linhagem Celular Expressando Estavelmente um Replicon Repórter Do Vírus Zika. Dissertação. 2019. 69f. (Mestrado em Biociências e Biotecnologia em Saúde) – Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2019.
Autor
Silva, Caroline Simões da
Institución
Resumen
O vírus Zika (Zika virus, ZIKV) é um arbovírus membro da família Flaviviridae e gênero
Flavivirus. Seu genoma é de RNA de sentido positivo e constituído por única matriz de
leitura, responsável pela tradução das proteínas virais estruturais e não estruturais, ladeada por
terminações não codificantes nas extremidades 5ˈ e 3ˈ. Atualmente, a ausência de vacinas ou
fármacos anti-ZIKV licenciados e o número de casos reportados de infecções por ZIKV, além
das complicações neurológicas decorrentes das infecções pelo vírus, colocam as infecções por
ZIKV como um grande problema de saúde pública, sobretudo em regiões tropicais e
subtropicais. Diante disso, o presente trabalho objetivou a construção de uma linhagem
celular expressando estavelmente um subgenoma autoreplicativo (replicon) do ZIKV,
expressando o gene repórter luciferase firefly (FLuc). Para tal, foi utilizado o genoma do
ZIKV cepa ZIKVPE243/2015, previamente isolado em Pernambuco e clonado no vetor
pSVJS01. A construção foi dividida estrategicamente em 3 fragmentos: i) o primeiro,
abrigando a extremidade 5ˈUTR e a sequência do capsídeo do ZIKV; ii) o segundo, formado
pelo gene repórter FLuc, uma região de ubiquitinação, gene da neomicina fosfotransferase e o
IRES (Internal ribosome entry site) do vírus da encefalomiocardite; iii) o último fragmento,
formado pelas proteínas não estruturais do ZIKV. Após a recombinação homóloga, a
identidade do replicon, denominado de repZIKVPE243-LucNeoIres, foi confirmada através
de PCR e sequenciamento. Transcritos in vitro produzidos a partir do cDNA clonado foram
transfectados em células BHK-21 por eletroporação. Três dias após a transfecção, as células
foram selecionadas em meio com geneticina (600µg/mL) e a linhagem celular recombinante
obtida, BHK-21-rZIKV-LucNeoIres, foi avaliada quanto à expressão de FLuc. Durante 20
passagens, as células BHK-21-rZIKV-LucNeoIres apresentaram um aumento da atividade da
FLuc de no mínimo 20 vezes em relação ao controle negativo. Por fim, a linhagem celular
recombinante BHK-21-rZIKV-LucNeoIres poderá ser usada para o desenvolvimento de uma
plataforma biotecnológica para triagem em larga escala de compostos anti-ZIKV e em estudos
sobre a replicação viral.