Impactos do silenciamento do RNA não codificante PCA3 em células de câncer de próstata

Abstract

Introdução: O PCA3 é um RNA não codificante (ncRNA), expresso especificamente na próstata, estando envolvido no controle da sobrevivência de células de carcinoma de próstata (CaP), através da via de sinalização do receptor de androgênio (AR). Objetivo: Investigar se diversos genes relacionados ao câncer – incluindo os envolvidos na Transição Epitelial Mesenquimal (EMT), os que apresentam potencial stemness e os co-reguladores do AR – podem estar envolvidos no processo de resposta ao silenciamento do PCA3. Além disso, objetivamos promover o silenciamento estável do PCA3 através da construção de um vetor lentiviral carreando short hairpin RNA (shRNA) específico para este ncRNA, vislumbrando estratégias terapêuticas para o CaP. Metodologia: Empregamos small interfering RNA (siRNA) ou shRNA com expressão baseada em vetores lentivirais para diminuir a expressão de PCA3 em células LNCaP e avaliar os efeitos deste silenciamento na sobrevivência destas células. Para isto, analisamos por qRT-PCR a expressão do PCA3 e de diversos genes relacionados ao câncer. Utilizamos microscopia confocal para analisar a expressão da proteína vimentina. Empregamos citometria de fluxo para verificar o percentual de células LNCaP GFP+ e, azul de tripan para avaliar o número de células viáveis, após o silenciamento estável do PCA3. Resultados: Dentre os co-reguladores do AR, ARA 70, ARA 54, Smad3 e EBP1 apresentaram expressão aumentada nas células LNCaP interferidas com siPCA3 em relação às células LNCaP interferidas com siScrbl, enquanto Smad 4 e ciclina D1 apresentaram expressão diminuída. Dentre 84 genes relacionados ao câncer, 16 apresentaram expressão alterada em células LNCaP- siPCA3 em relação ao controle. Destes, 30% codificam moléculas de transdução de sinais e fatores de transcrição. Observou-se expressão aumentada de E-caderina, Claudina-3, Citoqueratina-18, Snail, Twist e Slug em células LNCaP -siPCA3 em relação ao controle, enquanto observou-se expressão diminuída de Claudina-4, Citoqueratina-8 e Vimentina. O padrão de marcação de vimentina foi similar em células LNCaP – siPCA3 e células LNCaP – siScrbl. Não foi detectada a expressão de genes com potencial stemness nas condições testadas. Células transduzidas com vetores lentivirais carreando shPCA3 apresentaram diminuição estável da expressão do PCA3. Foi observada redução estável de cerca de 60% de células LNCaP GFP+ transduzidas com shPCA3, além de redução no número de células viáveis. Conclusão: O silenciamento do PCA3 reduz o número de células viáveis, através de um processo que envolve moléculas de transdução de sinais e fatores de transcrição que podem orquestrar a sobrevivência das células de CaP. A diminuição no número de células viáveis após a transfecção com siPCA3 parece não ser modulada pelo programa EMT clássico, embora a reversão parcial deste programa possa estar regulando a diminuição da sobrevivência celular induzida por siPCA3. A desregulação da expressão de coreguladores do AR observada pode estar envolvida na inibição da expressão dos genes alvo do AR. Nossos dados sugerem que este ncRNA desempenha papel regulador na transcrição gênica, sendo capaz de modular a expressão de genes de diversas vias de sinalização relacionadas ao câncer. Nossos resultados sugerem ainda que a redução estável do PCA3 apresenta potencial aplicação em estratégia terapêuticas que visem modular negativamente a sobrevivência das células de CaP.