Autenticação molecular de 65 isolados clínicos e ambientais de Coccidioides spp. e seqüenciamento do gene CSA

Abstract

Coccidioidomicose é micose sistêmica causada pelos fungos dimórficos Coccidioides immitis e C. posadasii , adquirida através de inalação de artroconídios infectantes. Em parasitismo, expressa forma característica em esférula, repleta de endósporos. Em saprofitismo e em cultivo as colônias possuem aspecto macroscópico algodoado, de cor branca a marrom-claro, e microscopicamente apresentam hifas hialinas, septadas e ramificadas com esp aços interseptais cheios de citoplasma alternados com áreas interseptais vazias, formando artroconídios intercalares, unidades infectantes facilmente aerossolizáveis. O semi-árido brasileiro foi recentemente incluído como área endêmica de coccidioidomicose. Por ser altamente infectante, é importante implantar uma técnica de identificação molecular de Coccidioides spp., para minimizar os riscos de manipulação do operador. Ta mbém é importante conhecer a dinâmica do fungo no Brasil através de um estudo de vari abilidade molecular. Este estudo objetivou identificar os isolados suspeitos por meio de marcador molecular específico (gene CSA) que reconhece o gênero, e analisar a variabilidade molecular de linhagens brasileiras de Coccidioides spp. através de sequenciamento A extração de ADN foi realizada de 65 linhagens (58 do Piauí, Brasil; seis dos Es tados Unidos da América (EUA) e uma da Argentina), mantidas em Coleção de Cultura conforme técnica previamente descrita (Burt et al, 1995). Para a identificação do gênero foi utilizado um par de primers específicos (Ci 1 \2013 5 \0301 AAG TTC TCA CTC CTC AGC GCT ATC G 3 \0301 e Ci 2 \2013 5 \0301 ACA TTA AGG TTC CTC CCC TTC AAC C 3 \0301) que se anela ao gene CSA . Para a tipagem molecular, foi realizada Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) com os primers específicos de 57 linhagens. Após es ta etapa, o produto amplificado foi purificado com kit de purificação e posteri ormente seqüenciado na Plataforma de Seqüenciamento de ADN PDTIS/FIOCRUZ. Como resultado, obtivemos 100% de positividade na identificação das linhagens estudadas e em nenhuma das linhagens controle foi detectada a banda, demonstr ando que o método foi 100% específico e sensível. No seqüenciamento do gene CSA , realizado de 57 linhagens, 56 foram caracterizadas como Coccidioides posadasii e uma linhagem, proveniente dos EUA, foi caracterizada como Coccidioides immitis