O Pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma oleaginosa que se destaca pelo seu potencial para a produção de biodiesel. Uma abordagem por meio de marcadores moleculares para análise de variabilidade genética contribuirá no processo de melhoramento dessa espécie. Para tanto necessitam que suas reações de amplificação com primers ISSR (Intersimple Sequence Repeats) sejam estabilizadas, para que possam ter boa reprodutibilidade dos resultados. Esse trabalho teve como objetivo otimizar o protocolo de amplificação de marcadores ISSR para posterior caracterização molecular dos acessos de pinhão-manso. Ao analisar os efeitos gerados pelas modificações na reação de amplificação, verificou-se diferenças nos produtos de PCR gerados. Definiu-se melhor padrão de bandas na reação com: Tampão 1X [20 mM Tris-HCl pH 8,0; 0,1 mM EDTA; 1,0 mM DTT; 50% (v/v) glicerol]; MgCl2 a 3,0 mM; dNTP a 800 ?M; 1,2 pMol de primer, 1 U de Taq DNA polimerase, 1 ?l de DNA genômico (~15 ng) e 48°C para temperatura de anelamento. Com a continuação desse trabalho, a seleção de primers capazes de identificar loci polimórficos na espécie constitui-se em uma importante ferramenta para estudos de diversidade genética e caracterização molecular do pinhão-manso.