Envolvimento do proteoglicano de heparam sulfato no processo de secreção e internalização de catepsina B

Abstract

A interacao de cisteino-peptidases lisossomais, especialmente a catepsina B, com os proteoglicanos e de grande interesse para entender a remodelacao tecidual e a progressao tumoral. A presenca de.catepsina B na membrana plasmatica resulta em dissolucao focal de proteinas da matriz extracelular e permite as celulas tumorais invadirem o tecido. O mecanismo de secrecao e insercao de catepsina B na membrana plasmatica ainda nao esta totalmente esclarecido. Dados obtidos recentemente em nosso laboratorio sugerem que o heparam sulfato presente na superficie celular possa ser um sitio importante para ligacao de cisteino-peptidases na membrana plasmatica e na membrana basal. Portanto o estudo da interacao de catepsina B com glicosaminoglicanos e de grande interesse para entender a funcao biologica desta enzima. Para tanto, foram utilizadas celulas ovarianas de hamster chines (CHO-Kl) e sua mutante (CHO-745) deficiente na enzima xilosiltransferase. A expressao de catepsina B no meio condicionado e no extrato celular foi determinada por espectrofluorometria. A identificacao e quantificacao de proteoglicanos e glicosaminoglicanos foi feita por eletroforese em gel de agarose seguido por quantificacao da radioatividade. Em ensaios de imunocitoquimica para visualizacao endogena de catepsina B, o anticorpo primario foi o anticatepsina B humana e o anticorpo secundario foi o antilgG de coelho conjugado com Alexa Fluor 488. Em ensaios de imunocitoquimica para visualizacao de catepsina B exogena, foi utilizada catepsina B conjugada com fluor (Alexa Fluor 488). A celula selvagem (CHO-Kl) apresenta secrecao de heparam sulfato que aumenta ao longo do tempo (de 0 a 8 horas) e celula mutante (CHO-745), deficiente em xilosil-transferase, praticamente nao apresenta secrecao de heparam sulfato para o meio extracelular (Fig. 12). A celula CHO-K1 apresenta uma quantidade total celular de catepsina B 25 por cento maior do que a celula CHO745. Essa diferenca tambem e manifestada em relacao ao teor de enzima ativa, a atividade especifica de catepsina B nas celulas K1 e cerca de 31 por cento maior do que o clone 745 (Fig. 9). Alem disso, a celula selvagem possui 6 vezes mais catepsina B ligada a superficie celular do que a celula mutante (Fig. 10). As duas linhagens secretam a mesma quantidade de catepsina B no meio extracelular (Fig. 11). A secrecao de catepsina B ativa na celula selvagem aumenta ao longo do tempo (de 0 a 8 horas), enquanto a celula mutante secreta catepsina B ativa apenas nas duas primeiras horas (Fig. 12). A catepsina B secretada pela celula CHO-745 e mais labil que a enzima secretada pela celula selvagem. Conforme mostrado previamente, e sabido que o heparam sulfato e capaz de estabilizar a catepsina B em pH fisiologico. Catepsina B e heparam sulfato apresentam-se colocalizados em lisossomos e na superficie celular das celulas CHO(fgs26 e 27)a(au)