Estudos cinéticos de catepsina B purificada de carcinoma mamário de rato(Walker-256): interações com glicosaminoglicanos tipo heparina

Abstract

Estudos recentes tem mostrado que a catepsina B esta envolvida em processos que envolvem a degradacao da matriz extracelular, remodelacao tecidual, bem como metastases tumorais. Recentemente nosso grupo mostrou que a heparina e o heparam sulfato se ligam especificamente a catepsina B, este tipo de interacao provoca modificacoes estruturais na enzima, induzindo um aumento na sua estrutura de a-helice, que por sua vez estabiliza a estrutura da enzima em pH alcalino (J. Biol. Chem. 276, 944-951,2001). O objetivo deste trabalho foi verificar as interacoes entre o heparam sulfato e as formas tumorais de catepsina B. Celulas tumorais de carcinoma mamario de rato (Walker-256) foram cultivadas na cavidade peritonial de ratos Wistar. A catepsina B de origem tumoral foi purificada inicialmente por cromatografia em gel-filtracao em coluna Sephacryl S-200, posteriormente em coluna de troca ionica Mono-S e finalmente em coluna de afinidade Thiol Sepharose 413. A catepsina B tumoral foi parcialmente caracterizada por SDS-PAGE, imunoblotting, e ensaios de cinetica enzimatica monitorados por substrato fluorogenico Z-FR-MCA. Os resultados mostraram nao apenas a Ipresenca da forma convencional de catepsina B (28 kDa), como tambem a presenca de uma isoforma de maior massa molecular (55 kDa). A isoforma de 55 kDa se mostrou mais resistente inativacao em pH alcalino que o fenotipo normal de catepsina B. Analises de RT-PCR das lulas tumorais de Walker-256, mostraram a presenca de varios cDNA que podem codificar ia catepsina B, foi possivel identificar nas celulas tumorais a presenca de um cDNA com o manho muito superior a aquele que codifica para a catepsina B em celulas normais. Heparina heparam sulfato tambem se ligam a catepsina B tumoral e essas interacoes tambem tabilizam esta forma enzimatica em pH alcalino. Por intermedio de microscopia confocal foi possivel demostrar que a catepsina B extracelular colocaliza com o proteoglicano de heparam (fato no tecido tumoral