Análise do perfil de miRNAs envolvidos na resistência à morte celular em células de leucemia linfocítica crônica in vitro (MEC-1)

Abstract

This study aims to evaluate the profile of miRNAs in CLL lineage, to find changes related to greater survival rate of these cells. The strategy was the comparison of the miRNA profile expressed by B-1 cells from healthy donors and cell lineage from a patient with CLL (MEC-1). After analyzing the profile, we confirmed the change in the expression of miRNAs specific and evaluated the expression of BCL-2, BAX and p53 proteins in the samples. Method: Using B-1 cells from heathy donors enriched by cell sorter and cell line MEC-1 from a patient with chronic lymphocytic leukemia was used as an experimental model. The expression of 84 miRNAs involved in apoptosis was evaluated comparatively between these cells by PCR Array. To confirm the alteration on the expression of identified miRNAs in the first step was performed by specific primers by RT-qPCR, and the evaluation of the gene expression proteins involved in apoptosis pathway also by RT-qPCR methodology. Results / Discussion: Herein was observed that the MEC-1 cell line model shows alterations in a panel of 69 miRNAs, with 29 miRNAs up-regulated and 40 miRNAs down-regulated. Quantitative analysis showed an expression of the candidate miRNAs: miR-21-5p, miR-25-3p, miR-92a-3p, miR125b-5p, miR-1285-3p, miR30d-5p, miR-29c-3p, miR16-5p, miR141-3p, miR143-3p, miR-145-5p, miR34a-5p, miR34c-5p miR181a-5p. The miR-21-5p, miR30d-5p, miR-25-3p, miR-29c-3p, miR-92a-3p, miR125b-5p, miR16-5p, and miR181a-5p showed a greater expression in MEC-1 cells. It was found a robust deregulation in the miRNAs: 181a-5p, 21-5p and 125b-5p. The miR1285-3p, miR141-3p, miR143-3p, miR-145-5p, miR34a-5p, miR34c-5p showed reduced expression in MEC-1 cells, highlighting the miRNAs: 143-3p, 145 - 5p and 34c-5p. To confirm these results, we evaluated the expression of specific miRNAs: miR181a, miR34a, miR34c and miR15a16 by analyzing the relative expression. We observed that miR181a confirmed increased expression in MEC-1 cells, miR34a showed decreased expression and miR34c showed no difference in expression between samples. Corroborating the findings from literature, we also observed the decreased expression of miR15a and miR16-1 in the MEC-1 cell line. Alteration found in most patients with chronic lymphocytic leukemia due to high mutation rates on chromosome 13q14 in these patients. We also evaluated the expression of the BCL-2, BAX and p53 proteins, which provide a lower relative expression in MEC-1 cells. Conclusion: The data confirms a robust change in the miRNA profile related to the apoptosis pathway in leukemic cells. We also confirm that MEC-1 cells show a decrease in miR15a16, already characterized in this leukemia. This view about altered miRNAs, related to a longer cell survival, open new perspectives for studies about the future biomarkers for diagnoses and new therapeutic targets.

O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de miRNAs em linhagem de Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) visando encontrar alterações que possam estar relacionadas a maior sobrevivência destas células. Foi comparado o perfil de miRNAs expressos por células B-1 obtidas de indivíduos saudáveis e células de linhagem de paciente com LLC (MEC-1). Após análise do perfil, confirmamos a alteração de expressão dos miRNAs específicos e avaliamos a expressão das proteínas BCL-2, BAX e p53 nas amostras. Método: As células B-1 humanas provenientes de indivíduos saudáveis foram enriquecidas por cell sorter. Foi utilizado como modelo experimental a linhagem celular MEC-1 proveniente de paciente com leucemia linfocítica crônica. A expressão de 84 miRNAs envolvidos na apoptose foi avaliada comparativamente entre estas células por PCR Array. A confirmação da alteração na expressão dos miRNAs identificados na primeira etapa foi realizada por primers específicos por RT-qPCR. Também foi feita a avaliação da expressão gênica das proteínas da via de apoptose por metodologia de RT-qPCR. Resultados/Discussão: Foi observado que o modelo de linhagem de células MEC-1 apresenta expressão alterada em um painel de 69 miRNAs, onde 29 apresentaram super expressão e 40 apresentaram baixa expressão. Por análise quantitativa foi observada a expressão dos miRNAs candidatos: miR-21-5p, miR-25-3p, miR-92a-3p, miR125b-5p, miR-1285-3p, miR30d-5p, miR-29c-3p, miR16-5p, miR141-3p, miR143-3p, miR-145-5p, miR34a-5p, miR34c-5p miR181a-5p. O miR-21-5p, miR30d-5p, miR-25-3p, miR-29c-3p, miR-92a-3p, miR125b-5p, miR16-5p, e miR181a-5p demostraram uma maior expressão em células MEC-1. Destaca-se uma maior desregulação nos miRs: 181a-5p, 21-5p e 125b-5p. E o miR1285-3p, miR141-3p, miR143-3p, miR-145-5p, miR34a-5p, miR34c-5p demostraram uma expressão diminuída em células MEC-1, destacando uma maior regulação negativa dos miRs: 143-3p, 145-5p e 34c-5p. Para confirmar os resultados, avaliamos a expressão dos miRNAs específicos: miR181a, miR34a, miR34c e miR15a16 por análise da expressão relativa. Observamos que o miR181a confirmou sua expressão aumentada em células MEC-1, o miR34a apresentou sua expressão diminuída, já o miR34c não apresentou diferença de expressão entre as amostras. Corroborando os achados da literatura, também observamos a expressão diminuída do miR15a e miR16-1 na linhagem celular MEC-1. Alteração encontrada na maioria dos pacientes com leucemia linfocítica crônica devido a grandes taxas de mutação no cromossomo 13q14 desses pacientes. Também avaliamos a expressão das proteínas BCL-2, BAX e p53, que apresentaram uma expressão relativa menor em células MEC-1. Conclusão: Os dados confirmam que há robusta alteração no perfil de miRNAs relacionados a via de apoptose nas células leucêmicas. Confirmamos também que as células MEC-1 também apresentam a diminuição do miR15a16, já caracterizada nesta leucemia. Esta visão sobre outros miRNAs alterados, relacionados à maior sobrevida das células, abrem novas perspectivas de estudos para futuros biomarcadores para diagnósticos e novos alvos terapêuticos.