Comparação de diferentes meios para o cultivo ex vivo de células epiteliais do limbo

Abstract

Objetivo: Comparar a eficacia de tres diferentes meios de cultura para o crescimento, diferenciacao, proliferacao e viabilidade de celulas-tronco epiteliais do limbo cultivadas ex vivo. Metodos: As culturas de celulas epiteliais do limbo foram estabelecidas a partir de 10 rimas corneo-esclerais cultivadas em tres diferentes meios de cultura: Supplemental Hormonal Epithelial Medium (SHEM), Keratinocyte Serum-Free Medium (KSFM) e Epilife. O desempenho das culturas de celulas epiteliais do limbo em cada meio foi avaliado de acordo com os seguintes parametros: area de crescimento e migracao epitelial; imunocitoquimica para ATP-binding cassette member 2 (ABCG2), p63, Ki67, citoqueratina 3 (CK3) e vimentina (VMT); reacao em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) em tempo real para CK3, ABCG2 e p63, e viabilidade celular utilizando a coloracao Hoechst. Resultados: As celulas epiteliais do limbo cultivadas em SHEM apresentaram migracao mais rapida, em comparacao com KSFM e Epilife. A analise imunocitoquimica evidencia que as celulas cultivadas em meio SHEM apresentaram menor expressao de marcadores relacionados com celulas-tronco epiteliais (ABCG2), e celulas indiferenciadas (p63), e maior porcentagem de celulas positivas para epitelio diferenciado (CK3), quando comparado com KSFM e Epilife. Na analise da RT-PCR, a expressao de ABCG2 foi estatisticamente maior para Epilife em comparacao ao SHEM. A expressao de p63 foi estatisticamente maior para Epilife quando comparada com SHEM e KSFM. Por outro lado, expressao de CK3 foi significativamente menor em KSFM quando comparada com SHEM. Conclusao: Com base em nossos resultados, concluimos que as celulas cultivadas nos meios KSFM e Epilife apresentaram maior porcentagem de celulas-tronco epiteliais limbicas, quando comparadas com as celulas cultivadas no meio SHEM